四氢生物蝶呤经氧化应激相关途径对心肌损伤及心脏功能的影响机制研究

摘要

本文主要从以下几方面进行论述：
　　第一部分
　　目的：四氢生物蝶呤（BH4）是一氧化氮合酶(NOS)合成一氧化氮(NO）必须的辅助因子。基础及临床证据表明，BH4治疗能够改善由于BH4缺乏所致的病理生理障碍。交感神经兴奋与氧化应激相关，β-受体阻滞剂可抑制交感兴奋带来的心脏损害，二者共用是否具有协同作用尚未可知。本研究旨在探讨奈必洛尔联合BH4治疗对心肌氧化应激水平以及对一氧化氮/环磷酸鸟苷/蛋白激酶G(NO/cGMP/PKG)途径信号分子表达水平的影响，从而证实其是否对自发性高血压大鼠（SHRs)心脏舒张功能不全具有保护作用，二者联合治疗是否可产生协同效应，并初步阐明其相关机制。
　　方法：12周龄SHRs40只，随机分为5组（n=8）：基线组、安慰剂对照组、BH4组、奈必洛尔组、BH4+奈必洛尔组及同品系的雄性正常血压对照魏-凯二氏大鼠（WKYs）组（n=10）。应用小动物心脏彩超及右颈动脉插管导管法测定心脏功能；荧光探针法测定心肌活性氧类物质(ROS)；ELISA法测定心肌3-硝基酪氨酸（3-NT)含量、NO的生成量和环磷酸鸟苷(cGMP)在心肌的浓度；应用14C标记L-精氨酸转化为14C-L瓜氨酸的转化率，测定心肌内皮源性一氧化氮合酶（eNOS）活性；应用RT-PCR以及Western-blot测定eNOS、受磷蛋白（PLN)、肌质网钙泵2α亚型(SERCA2α)mRNA及相应蛋白表达水平，同时测定心脏β3肾上腺素能受体（β3-AR)、蛋白激酶G（PKG)在心肌表达水平。
　　结果:1.与WKYs大鼠组比较，SHRs存在相对性舒张功能相关指标减低，舒张早期血流峰值速度（E)与舒张早期二尖瓣环最大运动速度（E′)的比值（E/E′）增高（P＜0.01），而其与舒张晚期二尖瓣环运动速度（A′)比值(E′/A′)降低(P＜0.01)。
　　2.与对照组相比，BH4干预对SHRs血压和心率的影响无明显差异（P＞0.05），而奈必洛尔干预可显著降低血压和心率（P＜0.01）；与安慰剂对照组和BH4单药治疗组相比较，二者联合治疗可使心率和血压明显降低（P＜0.01），然而与奈必洛尔单药治疗组相比血压和心率没有变化（P＞0.05）；与对照组相比，BH4和（或）奈必洛尔单药干预有效减低左室舒张末压力（LVEDP）和E/E′，而增加E′/A′（P均＜0.01），并缩短左室松弛时间时间常数(tau)，使左心室压力下降最大速率(-dP/dtmax)与左室收缩压力(LVSP)的比值（-dP/dtmax/LVSP）更低（P均＜0.01)；二者联合治疗与单药治疗（BH4或奈必洛尔）比较具有协同作用（P＜0.05）。
　　3.与对照组比较，BH4和（或）奈必洛尔单药干预后，心肌eNOS mRNA的表达水平、eNOS二聚体的表达、eNOS活性、NO的生成量、p-PLN/SERCA2a、β3-AR、cGMP和PKG的表达水平明显增加(P＜0.05或P＜0.01)，而3-NT和ROS表达量明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，并且联合治疗组具有协同效应(P＜0.05或P＜0.01)。
　　结论：1.BH4或奈必洛尔单独治疗均可明显改善心脏舒张功能，其可能的机制为二者均促使心肌eNOS再耦联、增加eNOS活性，提高心肌NO生成；
　　2.奈必洛尔阻断β1-AR，降低心率和血压，同时兴奋β3-AR，再耦联eNOS，改善心脏舒张功能；
　　3.BH4与奈必洛尔相应剂量的联合治疗对降低心肌氧化应激、提高BH4/BH2的比值、增加eNOS活性、增加NO的生成，具有协同效应，从而对心脏舒张功能不全产生更明显的保护效应，其主效应经由再耦联eNOS，并通过NO/cGMP/PKG途径而发挥心脏保护作用。
　　第二部分
　　目的：肿瘤放射治疗诱发的心肌损害在临床较为常见，但其发生机制有待进一步探讨，治疗手段有限。本研究旨在探讨BH4干预是否对X线辐射诱导抑制心肌细胞增殖、促进凋亡、氧化应激等损伤产生保护效应及其相关的作用机制。
　　方法：应用克隆形成法实验检测X射线和X射线+BH4干预对H9c2心肌细胞增殖活力的影响；测定X射线和X射线+BH4干预对心肌细胞乳酸脱氢酶（LDH)含量、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛(MDA)水平，以明确辐射对H9c2心肌细胞氧化应激水平的变化情况；Hoechst33342染色检测细胞凋亡变化情况；碘化丙锭染色，流式细胞术检测辐射对H9c2心肌细胞周期分布的影响；采用
　　Western blot法检测PI3K/Akt/P53信号通路蛋白的表达水平以及内皮型一氧化氮合酶（eNOS)蛋白表达水平，同时也明确诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达变化情况。
　　结果：X线辐射剂量依赖性地抑制H9c2心肌细胞的增殖、促进细胞凋亡和细胞周期G0/G1期阻滞（P＜0.01)；增加LDH释放、MDA浓度和NO的产生，降低SOD在心肌细胞中浓度（P＜0.05或P＜0.01，而BH4治疗则显著逆转X射线辐射造成的损伤（P＜0.05或P＜0.01）；X线辐射可显著上调Bax、p53和caspase-3的表达水平，同时下调PI3K、Akt、p-Akt和Bcl-2的表达水平；BH4治疗显著下调Bax、p53和caspase-3的表达，而上调PI3K，Akt、p-Akt和Bcl-2的表达（P＜0.05或P＜0.01）；BH4上调2、4Gy辐射组eNOS表达,同时下调iNOS的表达（P＜0.05或P＜0.01），最终的净效应是增加eNOS来源NO的生成量。
　　结论：BH4干预可以改善X射线诱导的H9c2心肌细胞的损伤，其机制可能是通过增加eNOS的再耦联而不是iNOS再耦联，同时降低由X线诱导心肌细胞氧化应激水平及抑制细胞凋亡而发挥对放疗心肌损伤的保护效应。

目录

声明

缩略语表

第一部分 奈必洛尔联合四氢生物蝶呤对自发性高血压大鼠舒张功能不全的保护效应及机制研究

1.1前言

1.2材料与方法

1.3数据统计分析

1.4结果：

1.5讨论

1.6 结论

参考文献

第二部分 四氢生物蝶呤对放射诱导的H9c2细胞损伤影响的实验研究

2.1前言

2.2材料与方法

2.3统计分析

2.4结果

2.5讨论

2.6结论：

参考文献

研究总结

一、本研究创新点

二、本研究结论

研究展望

综述：Section 3 Heart Failure with Preserved Ejection Fraction in Hypertension:can tetrahydrobiopterin and nebivolol be a new combination therapy?

附件

在学期间的科研成果

致谢