朱砂和其他含汞化合物肾脏的摄入和外排差异比较研究

摘要

目的：探索朱砂与HgS、HgCl2、MeHg肾脏的摄入和外排的差异。 方法：1、建立UPLC-ICP/MS定量分析方法，以检测HEK 293T细胞内外无机汞和甲基汞含量变化。 2、HEK 293T细胞种于96孔板中，设置空白对照组、HgCl2组（0.2μM）、MeHg组（0.2μM）、HgS组（0.2μM）、朱砂组（0.2μM）5个实验组，每组6孔。各供试品经前处理后，分别与细胞孵育48h后，在避光条件下加入20μL MTT， 4h后小心吸出上清后加入150μL DMSO，在490 nm波长处检测吸光度值。 3、HEK 293T细胞种于6孔板中，设置空白对照组、HgCl2组（0.2μM）、MeHg组（0.2μM）、HgS组（0.2μM）、朱砂组（0.2μM）5个实验组，每组6孔。各供试品经前处理后，分别与细胞孵育24h、36h、48h后，用 PBS清洗并轻轻吹打细胞后收集于2 mL离心管中，室温下179 × g，离心3 min。 重复以上操作两次后，收集细胞内汞样本（加入2 mL 0.3%Triton X-100，常温下静置10 min后，取出），检测细胞内汞含量。 4、HEK 293T细胞种于6孔板中，设置空白对照组、HgCl2组（0.2μM）、MeHg组(0.2μM) 、HgS组（0.2μM）、朱砂组（0.2μM），每组6孔。各供试品经前处理后与细胞孵育48h后，用 PBS清洗3次，加入含9%胎牛血清 DMEM高糖培养基再继续分别培养24h、36h (共孵育培养72h、84h)。收集细胞外液（即培养基），检测细胞外汞含量。 5、将HEK 293T细胞接种于6孔板中，设置空白对照组、HgCl2组（0.2μM）、MeHg组 (0.2μM)、 HgS组（0.2μM）、朱砂组（0.2μM），每组6孔。各供试品经前处理后与细胞分别孵育24h、36h、48h，用PBS清洗三次后，每孔加入1 mL Trizol裂解细胞。同样将HEK 293T细胞接种于6孔板中，设置空白对照组、HgCl2组（0.2μM）、MeHg组 (0.2μM)、HgS组（0.2μM）、朱砂组（0.2μM），每组6孔。各供试品经前处理后与细胞孵育48h后，用PBS清洗3次后，每孔加入1 mL Trizol裂解细胞。用Real-Time PCR法检测肾脏转运体mRNA的表达。 结果：1、建立了快速、准确、灵敏的UPLC-ICP/MS定量分析检测方法，可以满足检测细胞内外无机汞以及甲基汞浓度变化的要求。 2、给予同等摩尔质量的氯化汞、甲基汞、硫化汞、朱砂（0.2μM）后，MTT实验表明细胞存活率分别为90.97%，90.32%，91.88%，91.45%。 3、细胞内汞实验表明，24h细胞内氯化汞组中无机汞含量为0.48%（占加入量的百分比），而硫化汞、朱砂组中无机汞的含量则低于0.039μg/L（定量下限为0.039μg/L）。甲基汞组中有机汞含量为8.43%（占加入量的百分比），而24h细胞内硫化汞和朱砂组中有机汞的含量则低于0.039μg/L（定量下限为0.039μg/L）。36h细胞内氯化汞组、硫化汞组、朱砂组中无机汞含量分别为2.41%、1.58%、0.36%（占加入量百分比）。甲基汞组、硫化汞组、朱砂组中有机汞的含量为10.31%、0.77%、0.14%（占加入量百分比）。48h氯化汞组、硫化汞组、朱砂组中细胞内无机汞的含量为3.00%、2.40%、2.20%（占加入量百分比）。48h细胞内甲基汞组、硫化汞组、朱砂组中有机汞的含量为15.38%、0.79%、0.19%（占加入量百分比）。结果表明，随着时间的增加，朱砂组和硫化汞组细胞内汞无机汞含量不断增加，并在48h时达到高峰且其入胞速度远低于氯化汞和甲基汞组。 4、细胞外汞实验表明，24h（共孵育培养72h）细胞外氯化汞组、硫化汞组、朱砂组中无机汞的含量为68.28%、74.01%、81.35%（占细胞内汞含量百分比）。24h细胞外甲基汞组、硫化汞组、朱砂组中有机汞的含量为63.55%、1.06%、1.14%（占细胞内汞含量百分比）。36h（共孵育培养84h）细胞外氯化汞组、硫化汞组、朱砂组中无机汞的含量为71.80%、81.17%、89.02%（占细胞内汞含量百分比），84h细胞内甲基汞组、硫化汞组、朱砂组中有机汞的含量分别为66.96%、1.34%、1.40%（占细胞内汞含量百分比）。结果表明，在84h时朱砂组无机汞的外排含量最多。 5、在24h、36h以及48h 时朱砂组、硫化汞组、氯化汞组以及甲基汞组对摄入转运体Cnt2以及Octn1的mRNA几乎没有影响。在72h时硫化汞和朱砂组组使Mdr1的mRNA的表达显著增加，朱砂组和硫化汞组分别在72h和48h时使Mrp2的mRNA水平增高。而甲基汞组和氯化汞组对Mrp1、Mrp2、Mrp4 mRNA水平几乎没有影响。 结论：1、朱砂和其他含汞化合物的转运不同，且其入胞速度远低于HgCl2和MeHg，出胞速度较HgCl2和MeHg快。 2、HgS和朱砂的外排可能与肾脏转运体Mdr1、Mrp2有关。

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丁通,骆骄阳,韩旭,杨世海,林瑞超,杨美华.朱砂毒性的研究进展及配伍必要性分析[J]. 中

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