金黄色葡萄球菌L型特性、形成机制及致病性研究

摘要

目的：
　　探讨金黄色葡萄球菌L型的特性、形成机制及致病性。
　　方法：
　　建立金黄色葡萄球菌不稳定型 L型模型，使用原子力显微镜检测 L型形貌及胞内压变化。将转化获得的Newman-pCM29和Newman-PAH9与野生株混合诱导培养后，选用激光共聚焦显微镜观察 L型形成中细菌间的相互作用；荧光显微镜观察“油煎蛋样”菌落的生长方式；测定野生型和 L型的zeta电位，分析细菌 L型呈聚集生长的原因；光学显微镜和透射电子显微镜观察 L型的增殖方式；选用药敏纸片琼脂扩散法测定金黄色葡萄球菌L型对抗菌药物的敏感性。选用体外溶血试验判断金黄色葡萄球菌 L型形成中溶血能力的变化；利用小鼠皮下感染模型检测金黄色葡萄球菌 L型的致病性。选用转录组测序检测金黄色葡萄球菌野生型转变为L型过程中基因组表达谱的变化，通过Q-PCR验证生物信息学分析结果。应用激光共聚焦显微镜评价荧光蛋白标记金黄色葡萄球菌后对L型生物学特性和野生型致病性研究的影响。
　　结果：
　　1.金黄色葡萄球菌L型呈现多形性，具有粗糙的表面，与野生型（61.4±5.0 kPa）相比拥有较高的胞内压（68.6±7.0 kPa），差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　2.金黄色葡萄球菌L型形成中不同来源的菌落间界限分明。L型形成的“油煎蛋样”菌落的致密核心部分嵌入琼脂生长。用 PBS冲洗后的菌落核心部分及冲洗液中的细菌均具有形成“油煎蛋样”菌落的能力；L型相对于野生型（-16.5mV）携带较少的zeta电位值（-7.7mV），差异具有统计学意义（P＜0.05）。金黄色葡萄球菌L型增殖中出现了向胞外的起泡，出芽及内生囊泡多种形式。
　　3.金黄色葡萄球菌L型在诱导12小时后的药敏试验结果显示，与野生型相比，除了对头孢曲松耐药外，对抗菌药物的敏感性呈现增加趋势，抑菌环的直径普遍较野生型增大。在诱导24小时后的药敏试验结果显示，与野生型比较，对头孢曲松、四环素和红霉素耐药，对左氧氟沙星和利奈唑胺敏感，对万古霉素、复方新诺明和氯霉素的敏感性呈现下降趋势。
　　4.在高渗L型诱导血平板上诱导的金黄色葡萄球菌L型在培养72小时后可形成明显的β溶血，而在高渗血平板上培养的野生对照型培养10天仍未形成明显溶血。金黄色葡萄球菌 L型可导致小鼠皮下的化脓性感染，并可在病变组织中分离出野生型，诱导出L型。
　　5.金黄色葡萄球菌L型形成和生存在过程中，与野生型比较，有96个基因下调和62个基因上调；差异表达基因主要集中在细菌的能量代谢、压力响应、蛋白质合成、RNA代谢和毒力因子的表达等信号传导通路。
　　6.荧光标记蛋白标记金黄色葡萄球菌后，有助于L型的“油煎蛋样”菌落和嵌入式生长观察；用荧光分布和强度可有效判断野生型在小鼠病变组织中的分布范围和数量，分析金黄色葡萄球菌的毒力。
　　结论：
　　1.不稳定型金黄色葡萄球菌 L型具有高胞内压和高度异型性特征； L型菌落呈嵌入式生长，仍遵循一个细菌形成一个菌落的原则；L型菌落的边缘和核心部分的细菌均具备增殖能力；L型的聚集特性与其zeta电位小有关；可通过起泡、出芽和囊泡的形成方式增殖；金黄色葡萄球菌 L型对除了左氧氟沙星、氯霉素和利奈唑胺外的大多数抗菌药物耐药。
　　2.金黄色葡萄球菌L型在高渗环境中较野生型具有更强溶血能力；金黄色葡萄球菌L型仍具有致小鼠皮下感染能力。
　　3.金黄色葡萄球菌L型的形成和生存与参与能量产生、压力响应、蛋白质合成、RNA代谢和毒力调节活动等的基因和信号传导通路有关。
　　4.使用荧光标记金黄色葡萄球菌可有效提升其 L型形成和野生型毒力研究的效果。

目录

声明

第一章 金黄色葡萄球菌L型特性和基因表达谱研究

1.1 前言

1.1.1细菌L-型的生物学特性研究

1.1.2细菌L-型形成机制研究

1.1.3金黄色葡萄球菌L-型的相关研究

1.1.4本项目研究的目的和意义

1.2 材料与方法

1.2.1 主要的仪器设备

1.2.2 主要试剂和材料

1.2.3 菌株和质粒

1.2.4 实验动物

1.2.5 主要试验方法

1.3 结果

1.3.1 金黄色葡萄球菌L型模型的成功建立

1.3.2金黄色葡萄球菌L型生物物理特性研究结果

1.3.3 金黄色葡萄球菌L型菌落形成中细菌间的相互作用研究结果

1.3.4金黄色葡萄球菌L型嵌入式生长观察和zeta电位测定结果

1.3.5 金黄色葡萄球菌L型增殖特征观察结果

1.3.6 金黄色葡萄球菌L型溶血特性研究结果

1.3.7 金黄色葡萄球菌L型与野生型药物敏感特性对比

1.3.8 金黄色葡萄球菌L型致小鼠皮下感染的研究结果

1.3.9 金黄色葡萄球菌L型形成过程中相关差异表达基因

1.4 讨论

1.5 结论与展望

1.5.1 结论

1.5.2 展望

第二章 荧光报告基因标记对金黄色葡萄球菌L型及野生型毒力研究的影响

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1 主要的仪器设备

2.2.2 主要试剂和材料

2.2.3 菌株和质粒

2.2.4 主要试验方法

2.3 结果和讨论

2.3.1 荧光报告基因标记对金黄色葡萄球菌L型菌落和生长方式研究的影响

2.3.2 荧光报告基因标记对金黄色葡萄球菌L型毒力研究的影响

2.3.3 荧光报告基因标记对金黄色葡萄球菌体内毒力研究的影响

2.4 结论

参考文献

在学期间的研究成果

中英文对照缩略词表

致谢