富血小板血浆负载人脂肪来源干细胞促进小鼠压疮愈合的实验研究

摘要

目的： 探讨富血小板血浆负载人脂肪来源干细胞对小鼠压疮创面愈合的影响及潜在的治疗机制，为压疮的干细胞疗法提供实验研究资料。 方法： 1.从临床削薄皮瓣手术中获取皮下脂肪组织，采用机械分离联合Ⅰ型胶原酶消化法从人脂肪组织中分离提取ASCs ，用含10%FBS+1%双抗（青霉素+链霉素）的L-DMEM培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养，传至第3代后行慢病毒转染和绿色荧光蛋白标记（病毒滴度为1×108TU/ml），设置感染复数MOI分别为1、10、25、50、75、100，取最佳MOI进行细胞转染。 2.行三系诱导分化，分别用茜素红、阿利辛蓝、油红染色鉴定三系诱导效果；运用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD90、CD105、CD73、CD34、CD11b、CD19、CD45及HLADR的表达情况。 3.采集志愿者外周血70ml，采用三次离心法制备富血小板血浆并进行血小板计数，与正常外周血进行比较。 4.取6只野生型C57BL/6J雌性小鼠（6-8周）建立压疮模型，简述之为：腹腔麻醉后，背部剃毛，在小鼠背部中线两侧对称部位相距5mm处轻轻提起皮肤，用大小为12mm×5mm，重约4.8g磁铁加压皮肤缺血12小时后去除磁铁，缺血12h、灌注12小时为1个循环，共两个循环，分别于建模后第1天和第5天行HE染色观察，第 1 天可见正常皮肤结构破坏，出现组织水肿，少量炎性细胞浸润；第 5 天出现大量炎性细胞浸润，组织细胞变性坏死，确认压疮模型建立成功。按此方法大规模建立压疮模型，按随机表法分为4组，每组15只，即富血小板血浆负载脂肪来源干细胞处理组（hADSCs+PRP组）、脂肪来源干细胞处理组（hADSCs组）、富血小板血浆处理组（PRP组）和磷酸缓冲盐溶液处理组（NC组）。在压疮模型建成后第一天，hADSC+PRP组予以100μl PRP重悬第3代脂肪来源干细胞（1×106），hADSC组予以100μl PBS重悬第3代脂肪来源干细胞（1×106）和局部移植至创面边缘及基底部，PRP组和NC组分别取100μl PRP或者PBS局部移植至创面。 5.创面处理后跟踪观察各组创面愈合情况，于1天、5天、9天、13天、17天及21天进行拍照，Image J软件计算创面大小。分别于5天、11天、21天取创面皮肤组织行组织学检查，HE染色观察创面皮肤结构，马松染色观察各创面胶原沉积及排列情况，相对胶原表达量为显微镜(×400)倍下随机选取5个视野，运用Image J软件计算红色面积；CD31免疫组织化学染色观察创面皮肤血管新生情况，选取5个视野后Image J软件计数新生血管数目；S100免疫组织化学染色观察创面皮肤神经再生情况，选取5个视野后Image J软件计算阳性表达的百分比。于11天取创面组织行冰冻包埋切片追踪细胞定植及存活情况。 6.统计学分析 实验结果采用均数±标准差(x±s )表示，采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。计量资料数据经正态性检验后，组间比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA)，组内多重比较方差齐性时采用LSD法检验，方差不齐时采用Dunnett' s T3法检验；同一时间点两组的比较采用独立样本t检验；P值<0.05为有统计学意义。 结果： 1. 从人皮下脂肪组织中成功分离出脂肪来源干细胞，原代细胞杂质较多，贴壁速度缓慢，48小时可见大部分细胞贴壁生长，呈梭形、多角形，细胞间可见其相互交联；传代培养至第三代时见细胞形态规则，呈长梭形，相互交联。经慢病毒转染检测见MOI为25时细胞转染率高达80%左右，取其作为作为最终细胞转染病毒浓度对细胞细胞进行转染，转染后于72小时倒置显微镜下拍照观察可见细胞传染率在90%以上，细胞生长良好。 2. 经三系诱导分化后见人脂肪来源干细胞（hADSCs）具有成骨、成软骨、成脂分化功能；流式细胞结果显示 CD90、CD105、CD73呈阳性表达，CD34、CD11b、CD19、CD45及HLADR呈阴性表达。 3. 成功分离出富血小板血浆，检测得到富血小板血浆中血小板计数为641.2± 74.4×109/L，正常全血血小板约为208.4±68.9×109/L（t=5.781，P=0.029）。 4. 成功建立压疮模型，可见各组创面皮肤红肿、逐渐在创面周围可见炎性分泌物渗出，于第 1 天见正常皮肤结构破坏，出现组织水肿，少量炎性细胞浸润；第 5 天出现大量炎性细胞浸润，组织细胞变性坏死，确认压疮模型建立成功 。相对于hADSCs组、PRP组和NC组，hADSCs+PRP组创面愈合最快，于9天时痂皮基本完全脱落，创面基本完成愈合，而hADSCs组可见部分血痂附着，PRP组和NC组仍有痂皮覆盖；相对于其他各组，21天时可见hADSCs+PRP组创面被毛完全覆盖，生长旺盛，大部分被毛呈黑色生长，hADSCs组创周及创面毛发生长，未见明显裸露创面，NC组和PRP组仍可见大片创面皮肤裸露，无被毛生长。hADSCs+PRP组、hADSCs 组、PRP组及NC组的愈合时间为8.20±0.75天、13.20±1.17天、14.40±1.02天及15.60±1.63天；各组创面在5天的创面大小为：hADSCs+PRP组（0.42±0.02）cm2、hADSCs组（0.57 ±0.04）cm2、PRP组（0.69±0.03）cm2、NC组（0.86±0.03）cm2；9天的创面大小为：hADSCs+PRP组（0.04±0.01）cm2、hADSCs组（0.12±0.01）cm2、PRP组（0.40 ±0.02）cm2、NC组（0.47±0.02）cm2,在13天hADSCs+PRP组和hADSCs组已全部愈合、PRP组（0.12±0.02）cm2、NC组（0.22±0.03）cm2，在5、9、13天各组比较均有统计学意义（P<0.01）。组织学结果显示：第5天，各组见大量炎症细胞浸润，而hADSCs+PRP组炎症细胞浸润最轻，胶原沉积明显，PRP组与NC组胶原纤维较少，各组比较具有统计学差异（P<0.05）；第11天，hADSCs+PRP组创面明显缩小，胶原大量沉积，排列较其它各组有序，胶原之间空隙增宽，可见部分毛囊再生，hADSCs组和PRP组可见坏死痂皮存在，hADSCs组胶原含量较hADSCs+PRP组少，较PRP组和NC组多，PRP组和NC组胶原排列仍然杂乱无序，NC组仍可见大量炎症细胞浸润，各组比较具有统计学差异（P<0.01）；第21天，hADSCs+PRP组异常创面最小，大部分创面已恢复正常皮肤结构，可见大量毛囊等皮肤附属结构形成，创面表皮与真皮结合致密，表皮变薄，真皮增厚，胶原排列有序，hADSCs组皮肤可见部分附属器形成，未愈创面较hADSCs+PRP组大但较PRP组和NC组明显减小，PRP组和NC组皮肤未见明显附属结构形成，但NC组胶原纤维与PRP组比较排列杂乱无序并且含量较低；CD31免疫组织化学染色结果显示，相对于hADSCs组、PRP组及对照组，hADSCs+PRP组在不同的时间段均显示较多的新生的血管，差异有统计学意义（P<0.05）；第11天，各组新生血管较 5 天时增多， hADSCs+PRP 组与其他各组比较具有统计学差异（P<0.05）；21天，四组的新生血管数目均较前减少，但仍可见hADSCs+PRP组血管数目最多（P<0.01），而PRP组和对照组相比无统计学意义；通过检测施旺细胞的特征性标志物S100的表达，推断压疮创面神经再生；S100免疫组化结果显示在第11 天， S100 标记的施旺细胞在 hADSCs+PRP 组和 hADSCs 组皮肤层散在表达，但hADSCs+PRP组与其他各组比较仍具有统计学差异（P<0.01）；21天时hADSCs+PRP组及hADSCs阳性表达区域最多，并覆盖皮肤全层，前者尤为明显，而PRP组只在真皮层见散在阳性表达，对照组阳性表达区域极少，各组之间存在统计学差异（P<0.01）；创面细胞追踪结果表明11天后观察ASC仍定植在创面皮肤内，其中hADSCs+PRP组残存的hADSCs较多。 结论： 富血小板血浆负载人脂肪来源干细胞局部移植通过减少炎症浸润、增加胶原沉积、促进血管新生和神经再生、提高hADSCs存活时间从而加速小鼠压疮创面愈合，提高愈合质量。

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[29] Jagannathan N S, Tucker-Kellogg L. Membrane p