巴西苏木素对金黄色葡萄球菌生物膜影响的研究

摘要

目的：探讨巴西苏木素（brazilin, BN）对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）生物膜的形成及成熟生物膜的影响，为临床S. aureus生物膜相关感染的治疗提供实验依据。 方法：1、BN对S. aureus生物膜形成的影响：首先构建S. aureus生物膜模型，确定生物膜形成时间，通过刚果红平板法初筛生物膜为阳性的临床菌株；采用番红染色法测定S. aureus生物膜的形成能力；再通过结晶紫染色法观察S. aureus 的粘附情况，异硫氰酸荧光素-刀豆蛋白 A （ fluorescein isothiocyanate-conjugated concanavalin A, FITC-ConA）标记荧光显微镜技术和扫描电镜（scanning electron microscope, SEM）观察生物膜形成情况及对生物膜模型进行鉴定。其次采用微量肉汤稀释法分别测定 BN 和万古霉素（ vancomycin, VCM ）对实验菌株的最低抑菌浓度（ minimum inhibitory concentration, MIC ）。最后以VCM为阳性对照，采用结晶紫微孔板法和FITC-ConA标记荧光显微镜技术测定1MIC、1/2MIC、1/4MIC BN作用于S. aureus 6h、12h、24h、48h后对生物膜形成的影响。 2、BN联合VCM对S. aureus成熟生物膜的影响：将1/2MIC、1MIC、2MIC浓度的BN和VCM，单独及联合用药作用于S. aureus成熟生物膜6h、12h、24h、48h后，采用结晶紫微孔板法和平板菌落计数法分别测定OD值及计数细菌菌落数；再将上述不同浓度BN及VCM单独及联合用药作用于成熟的S. aureus生物膜48h后，分别于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜（confocal Laser scanning microscope, CLSM）、SEM下观察BN与VCM对S. aureus成熟生物膜的影响。 3、BN对S. aureus生物膜相关基因的影响：采用Trizol法对S. aureus生物膜总RNA进行提取，实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测1/2MIC、1MIC、2MIC BN作用于成熟生物膜6h、12h、24h、48h后，对icaA（intercellular adhesion A, icaA）、icaR （intercellular adhesion regulatory R, icaR）、辅助基因调节因子A（accessory gene regulator A, agrA）的影响。 结果：1、BN对S. aureus生物膜形成影响的结果：筛选50株临床菌株中有84%能形成生物膜，其中编号C-4-4生物膜形成能力最强，为本实验的实验菌株。粘附实验显示，2-4h玻片上几乎没有细菌粘附，4-6h玻片上有几个散在的细菌粘附，6-18h玻片上细菌相互聚集，18-36h出现紫色块状，36-48h紫色块状增多且增厚，48-72h局部紫色团块减少，细菌间变得疏松。荧光显微镜下观察，6h有几个散在的细菌，绿色荧光较少；12h细菌聚集，绿色荧光增多；24h有小块状绿色荧光；48h有大片绿色荧光，致密而厚重；72h有较疏松的绿色荧光。SEM下观察，6h细菌散在分布；12h细菌开始聚集，有少量的胞外基质；24h细菌胞外基质将细菌包裹；48h聚集成堆的细菌被胞外基质所包裹，可以看到膜状结构，偶而也可见散在的单个菌落；72h细菌聚集疏松。BN和VCM对S. aureus的MIC值分别为32μg/mL及0.5μg/mL。1MIC、1/2MIC、1/4MIC浓度BN作用于S. aureus 6h、12h、24h、48h后，除了6h、12h 1/4MIC BN无作用外，其余对生物膜形成均有作用，其中作用24h、48h效果最为显著， OD 值均下降 2 倍以上，分别由 0.726±0.119 下降至0.346±0.127，1.133±0.283下降至0.450±0.121。荧光显微下观察，随着作用时间的延长及BN浓度的增加对生物膜形成的抑制作用增强；其中以48h 1MIC BN效果最明显，仅见少量散在点状绿色荧光。 2、BN联合VCM对S. aureus成熟生物膜影响的结果：1/2MIC、1MIC、2MIC浓度的BN和VCM，单独及联合用药作用于S. aureus成熟生物膜6h、12h、24h、48h后，BN与VCM联合应用时效果较单用时明显，以48h 2 MIC VCM+2 MIC BN药物作用效果最佳，OD值由1.283±0.272下降至0.390±0.160；细菌菌落数由256.333±13.204下降至47.333±11.604；荧光显微镜下仅有少量绿色荧光；CLSM下可见大量红色荧光，偶见绿色荧光；SEM下膜状结构大量破坏，无胞外基质，出现散在的菌落。 3、BN对S. aureus生物膜相关基因影响的结果：1/2MIC、1MIC、2MIC浓度的BN分别作用于icaA、icaR和agrA基因6h、12h、24h、48h后；BN对icaA表达量下调，以48h 2MIC BN下调最明显，由1下降至0.313±0.917；BN对icaR和agrA表达量上调，以48h 2MIC BN上调最明显，分别由1上升至4.581±0.560、3.049±0.225。 结论：1、BN能够抑制S. aureus生物膜形成，在本实验范围内随着药物浓度的增加，效果越明显； 2、BN单独用药对S. aureus成熟生物膜有一定的破坏作用，而VCM单独用药对S. aureus成熟生物膜破坏不明显，BN联合VCM比单独用药对S. aureus成熟生物膜作用明显； 3、BN可能通过下调icaA及上调icaR和agrA基因的表达量而影响生物膜的形成。

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