初级纤毛对缺氧环境下PC12细胞抗氧化活性的影响

摘要

目的：研究缺氧环境中PC12细胞初级纤毛长度发生变化的规律及初级纤毛对PC12细胞在缺氧环境下抗氧化活性的影响。
　　方法：1、采用物理性缺氧及氯化钴模拟化学缺氧方法分别对PC12细胞进培养，缺氧培养时间分别0h、6h、18h，然后通过倒置相差显微镜观察细胞形态的变化情况并比较两种缺氧方式对PC12细胞造成的损伤程度，同时通过免疫荧光染色法观察并对比两种缺氧培养方式下PC12细胞初级纤毛的发生情况，确定一种为本实验中将采用的缺氧方法。
　　2、对PC12细胞进行缺氧培养，缺氧培养时间分别0h、6h、18h，于不同时间点观察细胞初级纤毛形态并测量其长度，研究缺氧培养前后，PC12细胞初级纤毛发生率及纤毛长度的变化规律。
　　3、对PC12细胞进行缺氧培养，于缺氧0h及18h后采用免疫荧光染色法观察HIF-1α、HIF-2α及Nrf2的核转位情况，同时于缺氧0h、6h、18h后采用RT-PCR法及WesternBlot法分别检测HIF-1α、Nrf2、VEGF及SOD的基因及蛋白表达情况。
　　4、采用RNAi干扰法抑制IFT88的表达从而干扰细胞初级纤毛的发生，通过检测IFT88的基因和蛋白表达情况以及初级纤毛的镜下观察来确认干扰效果，从而建立起RNAi法抑制初级纤毛发生的方法。
　　5、对初级纤毛被抑制后的PC12细胞进行缺氧培养，缺氧培养时间分别0h、6h、18h，于不同时间点观察细胞初级纤毛形态并测量其长度，研究初级纤毛发生被抑制后，PC12细胞初级纤毛在缺氧环境中的发生率及纤毛长度的变化规律。
　　6、研究缺氧培养对胞内缺氧相关因子HIF-1α、HIF-2α及Nrf2表达及发生核转位的影响，阐明初级纤毛被干扰后，上述因子及胞内HIF/HRE和Nrf2/ARE信号途径在缺氧时的激活情况，并通过RT-PCR法及WesternBlot法检测胞内VEGF及SOD的表达情况。
　　结果：1、物理性缺氧培养及氯化钴模拟化学缺氧培养后6h后，PC12细胞均未出现明显形态变化；缺氧18h后，细胞形态发生明显变化，其中化学模拟缺氧培养后PC12细胞皱缩严重，大部分细胞由贴壁转为悬浮，导致缺氧培养后的PC12细胞的初级纤毛不再发生，无法观察到缺氧时间与初级纤毛长度的相关性，因此本课题组确定采用物理性缺氧方法进行后续试验。
　　2、随着缺氧时间的增加，PC12细胞的初级纤毛的发生率显著下降，常氧培养（缺氧0h）时，初级纤毛发生率为60.0％；缺氧6h后，初级纤毛发生率下降为55.3%；缺氧18h后，初级纤毛发生率为41.4%。
　　3、随着缺氧时间的增加，PC12细胞初级纤毛的长度显著增长。未缺氧对照组初级纤毛的平均长度为0.64μm，缺氧6h试验组初级纤毛平均长度为1.34μm，缺氧18h试验组初级纤毛平均长度为2.02μm。
　　4、缺氧会引起PC12细胞内HIF-1α、HIF-2α、Nrf2发生明显核转位。
　　5、缺氧培养后胞内HIF-1α、VEGF、Nrf2的表达量显著增加，同时SOD表达量显著降低。
　　6、IFT88表达被干扰后，初级纤毛发生明显受到抑制，初级纤毛变成短棒状或斑点状。初级纤毛被干扰后，缺氧处理不再引起初级纤毛长度和发生率发生变化。
　　7、当PC12细胞初级纤毛被干扰后，缺氧环境下，HIF-1α、Nrf2、VEGF的表达均受到显著抑制，而SOD表达量无显著变化。同时，缺氧也不再引起HIF-1α、HIF-2α及Nrf2发生核转位。
　　结论：1.缺氧可以引起PC12细胞初级纤毛增长，并且随着缺氧时间的延长，纤毛长度也随之增加；但当IFT88蛋白的表达被干扰后，PC12细胞初级纤毛的发生会随之被干扰，缺氧不再引起初级纤毛长度发生变化。
　　2.初级纤毛可以影响PC12细胞在缺氧环境下的抗氧化活性，并通过一定途径将缺氧信号导入胞内，进而启动细胞抗缺氧机制。
　　总之，本实验从细胞水平上观察了缺氧时初级纤毛长度、形态和缺氧相关信号途径的变化情况，发现缺氧可以使PC12细胞的初级纤毛长度出现显著增加，同时激活胞内抗缺氧相关的信号途径。但当用RNAi法干扰初级纤毛的发生后，则脱纤毛细胞的初级纤毛在缺氧状态下不再延长，同时胞内的抗缺氧损伤相关信号途径也不能被激活。这些结果表明，初级纤毛可以影响PC12细胞在缺氧环境下的抗氧化活性，并参与启动胞内抗氧化损伤防护机制。这一发现对新型抗高原疾病药物的研发有着十分重大的意义。

目录

声明

英文缩略词表

第一章 前 言

1.1 缺氧与高原反应

1.2 HIF-α和Nrf2的研究进展

1.3 初级纤毛的结构

1.4初级纤毛的发生与解体

1.5影响初级纤毛长度的因素

1.6初级纤毛在部分信号通路中的作用

1.7 初级纤毛与缺氧的相关性

2 立题依据与技术路线

第二章 缺氧对PC12 细胞初级纤毛长度及发生率的影响

【摘 要】

2.1 材料与方法

2.2 方法

2.3 结果

2.4讨论

2.5结论

第三章 缺氧状态下PC12细胞抗氧化活性的变化

【摘 要】

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 初级纤毛对PC12细胞在缺氧状态下抗氧化活性的影响

【摘 要】

4.1 实验材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5结论

第五章 结 论

参考文献

硕士期间科研成果

致谢