基于多肽自组装技术构建内吗啡肽-1前药纳米传递系统及其脑靶向研究

摘要

内吗啡肽-1(Endomorphin-1,EM-1)为中枢神经系统(central nervous system,CNS)μ阿片受体的内源性配体，是一种理想的镇痛多肽药物，它具有与吗啡同等的镇痛效果，对于急性疼痛有强烈的抑制作用，且不易产生机体耐受、成瘾等严重副作用。但是由于EM-1分子水溶性好，给药后体内半衰期短、酶解稳定性差且难以透过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)，限制了EM-1在临床上的应用。本实验基于多肽自组装技术，创新地将多肽药物EM-1作为递送系统的一部分，通过单一插入二硫键，酯化构建一种多肽前药分子纳米结构，并进行脑靶向递送研究。
　　实验使用不同长度的亲脂性烷基碳链(C8、C12、C18)，通过共价连接对亲水性EM-1进行酯化修饰，两亲端通过二硫键(-SS-)及酰胺键(-CONH-)接合，考察不同酯化程度及连接键对后续自组装纳米结构的影响。实验成功合成并纯化得到C8-SS-EM1、C12-SS-EM1、C18-SS-EM1及C18-CONH-EM1四种纯度较高的EM-1两亲性前药分子。通过传统的纳米-沉淀法，使四种两亲性前药分子自组装形成纳米颗粒(Nano-particles,NP)水溶液，通过透射电镜(TEM)、粒度仪、圆二色谱(CD)仪、动力学模拟(MD)等仪器对纳米形态、粒径、二级空间结构以及前药分子自组装行为进行表征，结果显示，四种前药分子形成的微观形态各有不同，相对而言，亲脂端碳链越长形成的NP粒径越小、形态均一且体系稳定，同样的，相对酰胺键，含有二硫键的前药分子形成的NP体系总体特征较好，MD结果表明两亲性前药分子自组装形成NP的行为符合胶束形成原理，即自组装形成了纳米胶束。
　　小鼠温浴甩尾镇痛实验从药效学角度表明，相对母药EM-1，前药NP镇痛效果均得到改善，酯化修饰程度越高，镇痛效果越好，表明前药NP透过了BBB并且发挥镇痛活性。近红外活体动物成像以及离体脑组织荧光成像实验用于直观观测EM-1前药NP是否达到脑部，结果显示，裸鼠脑部均可以观测到包载有荧光探针DIR的四种前药NP的荧光信号，C18-SS-EM1NP信号最强且持续时间最长，再次验证前药N P能够透过BBB，且穿透能力同时受酯化程度和连接键影响。酶解稳定性实验用于考察EM-1及其前药NP在血浆及脑组织匀浆中受蛋白酶降解的情况，结果显示：相对于母药EM-1，酯化并自组装成NP的血液和脑组织酶解稳定性均显著提高；相对于酰胺键，二硫键的引入更易使母药EM-1从脑部释放出来发挥药效。体内药动学实验用于考察酯化前药C18-SS-EM1NP在体内的分布情况，结果显示C18-SS-EM1分子不仅能分布到血浆及肝脏，也能吸收入脑。
　　本研究以促进EM-1透过BBB发挥镇痛效果为目标，通过将EM-1酯化修饰形成两亲性前药分子，并且结合自组装技术形成纳米传递系统。聚集形成的NP有助于降低多肽药物的酶解作用、酯化修饰增强了整体分子的脂溶性、采用血液中稳定但脑内易断裂的二硫键，这些策略单独使用均可以提高多肽药物的脑摄取量，本实验成功构建的前药自组装NP起到了一举三得的效果。该技术渴望应用于神经肽类药物的脑靶向递送研究，为促进该类药物BBB通透性进行了有益的探索。

目录

声明

第一章 前 言

1. 1 血脑屏障

1. 2 多肽物质克服血脑屏障的研究进展及局限

1. 3 多肽自组装纳米技术的分类及其在克服血脑屏障方面的应用

1.4 内吗啡肽-1(EM-1)的研究进展

1. 5 实验的创新性

第二章 EM-1及其酯化多肽前药分子的合成及纯化

2. 1 设计思路

2. 2 实验材料

2. 3 实验方法

2. 4 实验结果

2. 5 讨论与结论

第三章 EM-1酯化多肽前药自组装纳米颗粒(NP)的配制及理化表征

3. 1 设计思路

3. 2 实验材料

3. 3 实验方法

3. 4 实验结果

3. 5讨论与结论

第四章 EM-1酯化多肽前药自组装NP的脑内递药研究

4. 1 设计思路

4. 2 实验材料

4. 3 实验方法

4. 4 实验结果

4. 5 讨论与结论

第五章 EM-1酯化多肽前药自组装NP的稳定性研究

5. 1 设计思路

5. 2 实验材料

5. 3 实验方法

5. 4 实验结果

5. 5 讨论与结论

第六章 EM-1酯化多肽前药自组装NP (C18-SS-EM1)的体内药动学研究

6. 1 设计思路

6. 2 实验材料

6. 3 实验方法

6. 4 实验结果

6. 5 讨论与结论

论文总结与展望

参考文献

缩略词中英文对照表

在学期间的研究成果

致谢

附录