杜仲叶和栀子提取物对谷氨酸钠诱导的肥胖小鼠自噬调控的影响及其机制的研究

摘要

目的：1.观察杜仲叶和栀子提取物对谷氨酸钠诱导的（MSG）肥胖小鼠自噬调控相关基因和蛋白的影响；2.通过超高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术分析杜仲叶和栀子提取物对MSG肥胖小鼠胆汁酸相关组分的影响；3.研究杜仲叶和栀子提取物中有效成分西红花苷和绿原酸对人肝癌HepG2细胞自噬的影响，探讨药物的作用机制。 方法：1.乳鼠出生1d后，皮下注射谷氨酸钠（4 g/kg/d），每天1次，共7d，正常对照组乳鼠皮下注射相应剂量的生理盐水（ 10μl/g/d ）。4周后将实验小鼠分为9组：正常对照组（ Normal ）、模型组（ Model ）、阳性对照药白藜芦醇组（ 100 mg/kg, RES）、杜仲叶提取物高剂量组（400 mg/kg, EEH）、杜仲叶低剂量组（100 mg/kg, EEL ）、栀子提取物高剂量组（ 400 mg/kg, GEH ）、栀子提取物低剂量组（100 mg/kg, GEL）、联用高剂量组（400 mg/kg+400 mg/kg, EEH+GEH）、联用低剂量组（100 mg/kg+100 mg/kg, EEL+GEL），每组10只。各组小鼠按上述剂量，分别灌胃给药8周后，处死。采用油红O染色法观察小鼠肝脏和附睾脂肪的脂质沉积情况；利用实时荧光定量PCR（Q-PCR）和免疫蛋白印记（Western Blot）方法分别检测各组小鼠肝脏和附睾脂肪自噬和炎症相关基因和自噬蛋白的表达变化。2.收集MSG小鼠胆汁经乙腈沉淀蛋白后， 采用 SEG protecol C18 ENDURO色谱柱（250 mm ×4.6 mm×5μm），流动相为4 mmol/l乙酸铵溶液-含0.05%甲酸和乙腈，梯度洗脱，流速1ml/min，进样10μl，电喷雾离子源（ESI）、负离子的多级反应模式（MRM）监测，LC-MS/MS同时测定小鼠胆汁酸各组分的浓度。3. 10μM油酸诱导 HepG2 细胞 24h建立脂质积聚模型，使用西红花苷（ 10μM ） ，绿原酸（30μM）及其联合（10μM+30μM）干预细胞24 h后，Western Blot分析细胞内自噬相关Beclin 1，LC3-II/I，p62，FXR，CREB蛋白的表达；Mitotracker-LC3B共染色免疫荧光法观察细胞线粒体自噬。 结果：1.油红O染色显示，与模型组相比，各给药组小鼠的肝脏及附睾脂肪细胞内橘红色脂滴明显减少，细胞边界清晰，EEL+GEL、EEH+GEH和RES作用效果最明显。2.QPCR结果显示，与模型组相比，各给药组不同程度上调肝脏中自噬相关基因ULK1、LC3-I、LC3-II、Atg5、Atg7、Beclin-1和Lamp2a的表达量（p<0.05）；而在附睾脂肪中，则不同程度的下调了这些自噬因子的基因表达，其中以EEH+GEH组的药效更佳。与此同时各给药组还不同程度的抑制促炎症因子TGFα、COL1α、MMP13、RELMα和增加抗炎因子MGL-1、CD206、IL-10的表达水平。3.Western Blot结果显示，与模型组相比，各给药组明显上调肝脏中RAB7、Beclin1、Atg5、CREB、CRTC2、PPARα、TFEB、PGC1α、AMPK、ULK1和LC3II/I的蛋白表达（p<0.05），同时显著性下调P62、FXR和P-mTOR蛋白的表达量（p<0.05）；而显著降低了附睾脂肪中RAB7、Beclin-1、Atg5、CREB、CRTC2、PPARα、TFEB、PGC1α、AMPK、ULK1和LC3II/I的蛋白表达（p<0.05），升高了P62、FXR和P-mTOR的表达量（p<0.05），其中均以EEH+GEH组的作用更佳。4.LC-MS/MS结果显示，与模型组相比各给药组明显下调肥胖小鼠胆汁中DCA、GDCA、GUDCA的含量（ p<0.05 ） ，同时明显上调 CDCA、UDCA、GCA、GCDCA 的含量（p<0.05），对LCA和TUDCA的含量影响不大。5.免疫荧光结果显示，与正常组相比，油酸诱导后HepG2细胞中线粒体自噬下降明显，而药物（ CRO ， CGA ， CRO+CGA）干预的细胞内线粒体自噬明显增加，其中CRO和CGA联合干预组细胞内线粒体自噬增加最为明显；Western Blot结果显示，各给药组不同程度增加Beclin1、CREB和LC3II/I的蛋白表达（p<0.05）同时明显降低FXR和P62的表达量（p<0.05）。 结论：综上所述，MSG肥胖小鼠肝脏和脂肪组织自噬基因水平均显著增加，肝脏自噬相关蛋白水平下降而脂肪自噬相关蛋白水平增加。各给药组不同程度改善了MSG肥胖小鼠肝和脂肪组织的自噬水平，并具有明显的抗炎作用；初步阐明了MSG肥胖小鼠胆汁酸亚组分含量的变化及各组药物调节肥胖小鼠胆汁酸含量的特征；体外实验也证实杜仲叶和栀子提取物的主要组分CRO+CGA联合给药能显著增加HepG2细胞中线粒体的自噬功能，初步揭示了杜仲叶和栀子提取物减肥调脂的自噬相关机制。

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中英文缩略词表2

杜仲叶和栀子提取物对谷氨酸钠诱导的肥胖小鼠肝脏及附睾脂肪中自噬调控相关基因和蛋白的影响

1 仪器、试剂与动物

1.1 主要仪器

2 方法

2.1 谷氨酸钠肥胖动物模型的建立

2.2 实验小鼠分组及饲养条件

2.3 杜仲叶和栀子提取物的减肥调脂药效验证

2.4 QPCR法检测自噬调控和炎症相关基因表达量

2.6 统计学分析

3 结果

3.1杜仲叶和栀子提取物的减肥调脂药效结果验证

3.2实时荧光定量PCR法检测谷氨酸钠诱导的肥胖小鼠肝脏及附睾脂肪中自噬调控和炎症相关基因mRNA

3.3 Westernblot法检测谷氨酸钠诱导的肥胖小鼠肝脏及附睾脂肪中自噬调控相关蛋白表达量的变

3.3.1 小鼠肝脏自噬调控蛋白表达量的变化

3.3.2 小鼠附睾脂肪中自噬调控蛋白表达量的变化

4 讨论

第二部分 超高效液相色谱-串联质谱技术分析杜仲叶和栀子提取物对谷氨酸钠诱导的肥胖小鼠胆汁中胆汁酸

2 实验方法

2.1 样品的前期处理

3 结果

1 仪器、试剂与动物

Mito Tracker Red CMXRos

AlexaFluor 488

南京凯基

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献