组蛋白去乙酰化酶1抑制对化学缺氧致H9c2心肌细胞水肿的保护作用及分子生物学-力学耦合机制的研究

摘要

心肌水肿是在心肌缺血早期及其它多种病理条件下均可被检测到的一种频发事件。心肌细胞的体积调节受到多种因素的制约，包括渗透压、通道蛋白、细胞体积敏感度以及细胞间水分布等。尽管已有大量研究成果表明，心肌水肿的发生、发展过程中涉及众多基因的表达水平的改变，但是，心肌水肿发生、发展的明确的分子生物学机制尚未被完全阐明。借助组蛋白去乙酰化酶（HDACs）与组蛋白乙酰化转移酶（HATs）对染色体的调节功能，表观遗传化修饰可对组蛋白及非组蛋白施加影响从而改变基因的表达。有研究表明，HDAC4抑制可以增强心肌细胞对缺氧/复氧的耐受程度，具体体现在，HDAC4抑制可上调缺氧/复氧对心肌细胞的增殖抑制并发挥抗凋亡的作用。但是，在缺氧环境中，HDAC1是否具有调节心肌细胞体积的能力，尚未有相关报道。
　　心肌细胞水肿的发生包括细胞基因表达谱的改变与细胞力学特性变化两个过程，关于心肌水肿发生、发展过程中，心肌细胞力学特点的变化及细胞膨大过程中具体的力学机制的研究成果也尚无相关报道。因此，从表观遗传学角度、组蛋白乙酰化修饰水平深入研究心肌细胞水肿发生发展过程中相关的分子生物学机制，将有助于我们深化对心肌水肿的认知，因而对改善缺血性心脏疾病的预后具有积极的意义。对于肌细胞水肿发生发展过程细胞力学性质改变的表征及分子生物学-力学耦合机制的研究将为全面理解心肌水肿的发生、发展提供新的视野及研究策略。
　　本论文通过体外实验的方法，构建了氯化钴（CoCl2）化学缺氧水肿心肌细胞模型；通过采用经典的分子生物学实验方法筛选并验证了HDAC1在心肌细胞水肿发生早期阶段的作用并对其相关分子生物学机制进行了初步的探索；通过采用基于原子力显微镜（AFM）的单细胞力学特性表征技术及理论物理学理论、方法，对化学缺氧水肿心肌细胞中组蛋白乙酰化修饰作用相关功能基因的分子生物学作用机制与细胞力学特性的变化、机制进行了有机的耦合，旨在从分子生物学、生物力学两个层面，全面探索心肌水肿发生的机制。并获得如下成果：
　　（1）CoCl2化学缺氧诱导H9c2心肌细胞发生损伤、凋亡、氧化应激失衡、细胞骨架重排以及H3、H4组蛋白乙酰化水平下调；基于免疫印迹的实验结果，化学缺氧H9c2心肌细胞内HDAC4、HAT1的表达水平并无显著的变化；CoCl2化学缺氧5h诱导H9c2心肌细胞内HDAC1的表达水平发生上调，由此推测， HDAC1在CoCl2化学缺氧诱导的心肌细胞水肿发生的早期阶段具有重要意义。
　　（2）H9c2心肌细胞经HDAC1特异性RNA干扰以及高选择性蛋白抑制剂处理后，CoCl2化学缺氧5h诱导的H9c2心肌细胞损伤作用、凋亡、氧化应激失衡、细胞骨架重排以及H3、H4组蛋白乙酰化水平下调的趋势减缓；免疫印迹实验结果显示，CoCl2化学缺氧诱导H9c2心肌细胞内Akt、pAkt、P38、pP38以及Bcl-2蛋白分子的表达水平发生下调，上调了P53、Bax、Caspase3与AQP1蛋白分子的表达水平；HDAC1抑制后，化学缺氧环境中H9c2心肌细胞AQP1蛋白分子的表达水平下调，Akt、pAkt、P38、pP38蛋白分子的表达水平上调，AQP1蛋白表达水平下调。上述实验结果揭示了HDAC1抑制具有保护H9c2心肌细胞免于CoCl2诱导的损伤的作用，其机制可能是HDAC1抑制通过逆转缺氧环境中H9c2心肌细胞内PI3K/Akt信号转导通路以及p38 MAPK信号转导通路相关分子的异常表达，从而部分抑制化学缺氧环境诱导的大鼠H9c2心肌细胞的增殖抑制及凋亡等不良细胞表型出现。
　　（3）基于AFM单细胞力学特性表征、细胞体积、细胞表面颗粒度的结果，化学缺氧5h下调了心肌细胞杨氏模量，上调了心肌细胞体积、表面颗粒度， HDAC1抑制可显著减弱上述改变的程度；数据拟合及理想物理模型显示，化学诱导的水肿心肌细胞体积与细胞刚度呈反比、与细胞表面颗粒度呈正比认为，细胞刚度在由化学缺氧导致的H9c2心肌细胞水肿发生、发展过程中扮演着重要的角色。HDAC1抑制对于化学缺氧导致的 H9c2心肌细胞的保护作用是通过增加细胞刚度实现的，其分子生物学机制是HDAC1抑制可调控水肿H9c2心肌细胞结构及运动性基因的表达水平，从而逆转缺氧导致的心肌细胞内细胞骨架重排及表达水平下降。
　　上述研究结果表明，组蛋白乙酰化修饰在心肌水肿发生过程中扮演着重要的角色，该种表观遗传修饰作用可能通过多条信号转导通路发挥作用，影响水肿心肌细胞表型的改变。不仅如此，分子生物学-力学的耦合机制在心肌水肿的病理进程中同样具有一定的意义。这为心肌水肿的实验室研究及临床诊治提供了崭新的视角与依据。

目录

声明

第一章 绪论

1.1引言

1.2心肌水平衡的生理学

1.2.1心肌细胞体积的调节

1.2.2细胞外的水分布

1.3心肌水肿对缺血-再灌注的二次应答

1.3.1心肌细胞水肿

1.3.2心肌间质水肿

1.3.3心肌水肿对IR损伤的影响

1.3.4心肌水肿的时间过程在心肌缺血再灌注过程中的角色

1.3.5心脏手术中的心肌水肿

1.4 MI情况外的心肌水肿

1.5心肌水肿的检测

1.5.1心肌水肿的实验室检测

1.5.2 MRI对心肌水肿的检测

1.6表观遗传学与心血管疾病

1.6.1 DNA甲基化修饰

1.6.2组蛋白修饰

1.6.3组蛋白氧化修饰

1.6.4微小RNA

1.7细胞力学研究的理论基础

1.8本文的主要研究内容

第二章 HDAC1 抑制对化学缺氧致 H9c2 心肌细胞水肿的保护作用及机制研究

2.1引言

2.2材料和方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.3结果

2.3.1 CoCl2化学缺氧对H9c2心肌细胞组蛋白乙酰化修饰相关分子表达的影响

2.3.2 HDAC1抑制对化学缺氧心肌细胞组蛋白乙酰化修饰相关分子表达影响

2.3.3 HDAC1抑制对化学缺氧导致的心肌细胞损伤的保护作用

2.3.4 HDAC1抑制对化学缺氧导致的心肌细胞氧化应激失衡的保护作用

2.3.5 HDAC1抑制对化学缺氧心肌细胞增殖、凋亡等相关蛋白表达的影响

2.3.6 HDAC1抑制对化学缺氧心肌细胞组蛋白乙酰化水平的影响

2.4讨论

第三章 HDAC1抑制对水肿H9c2心肌细胞力学特性的影响及生物力学耦合机制的研究

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.3结果

3.3.1 HDAC1抑制对化学缺氧致心肌细胞表面形貌改变的影响

3.3.2 HDAC1抑制对化学缺氧致心肌细胞体积膨胀表面颗粒度增大的影响

3.3.3 HDAC1抑制对缺氧心肌细胞刚度的影响

3.3.4 HDAC1抑制对缺氧心肌细胞骨架排布的影响

3.3.5 HDAC1抑制对化学缺氧环境下心肌细胞水肿发生过程的影响的经验公式拟合及理想物理模型的构建

3.4讨论

参考文献

在学期间的研究成果

致谢