油菜籽来源抗氧化肽RAP对糖尿病肾脏纤维化作用及其机制研究

摘要

研究背景和目的：糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最严重、最常见的微血管并发症之一。肾脏纤维化是DN的主要病理结局，也是晚期肾病（ESRD）的主要病因。DN的病理变化主要包括正常肾单位的丢失、大量成纤维细胞和肌成纤维细胞增生、细胞外基质（ECM）如胶原蛋白和纤连蛋白（FN）过量生成并堆积以及肾小球内 Kimmelsstiel-Wilson（KW）结节形成，并且伴随着肾小球与肾小管基底膜增厚、肾小管间质纤维化，最终导致肾小球硬化。目前防治DN的措施主要包括控制血糖、血压和血脂等，但目前临床和基础研究阶段的药物只能延缓而不能阻止DN的进展，且大都具有较严重的副作用。因此，寻找有效防治DN的方法与药物具有重要的理论与实践意义。植物来源的生物活性肽由于其潜在的营养和药用价值被广泛应用于各个领域，目前发现的这类多肽有降胆固醇肽、血管紧张素I抑制肽、抗菌肽、免疫调节肽和抗氧化肽等，但这类多肽目前还未应用于抗肾脏纤维化研究。鉴于氧化应激在DN中的重要作用，我们选择了具有抗氧化作用的多肽RAP（序列为YWDHNNPQIR），研究其在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病肾病模型和高糖诱导的肾小球系膜细胞（GMC）中的抗纤维化作用。 方法：（1）体内实验：8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠连续 5 天腹腔注射 STZ 45mg/kg/day，正常组注射相同体积的柠檬酸缓冲液，平衡72h后检测血糖，血糖值大于11.1mM认定为糖尿病模型成功，然后将小鼠随机分成正常对照组（normal control group，Control，n=6）、糖尿病模型组（diabetic model group，DM，n=8）、RAP低剂量组（RAP low dose group，0.1 mg/kg，RAP-L，n=8）和RAP高剂量组（RAP high dose group，0.1 mg/kg，RAP-H，n=8），进行隔天皮下注射给药，其中正常组给予相同体积的PBS 溶液，并同时给予糖尿病模型组和给药组高脂高糖饲料（HFD）喂养12周。实验结束前用代谢笼收集尿液检测尿蛋白，取血后检测血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）和血清TGF-β1水平。解剖收集肾脏后通过六胺银基底膜（PASM）、HE、Masson和天狼星红（Sirius Red）染色进行病理学检测，同时用Western Blot、RT-PCR和免疫组化实验检测 小鼠肾脏中TGF-β1、CTGF、FN和?-SMA的mRNA水平和蛋白水平表达，还检测了小鼠肾脏中ERK1/2、p38和p65的磷酸化水平。（2）体外实验：高糖诱导GMC细胞后用MTT实验检测RAP对细胞增殖的影响和毒性作用，确定RAP的最佳浓度为50μM和100μΜ。同时，在mRNA水平和蛋白水平，检测高糖诱导GMC细胞中TGF-β1、CTGF、FN和α-SMA的表达情况，及ERK1/2、p38和p65的磷酸化水平。此外，用ELISA实验检测细胞培养液中胞外基质FN和COL4的含量。 结果：（1）与糖尿病组相比，RAP能够改善DN肾脏纤维化症状，包括改善BUN、Scr和TG等肾脏指标，改善氧化应激指标SOD和MDA，抑制肾脏中TGF-β1、CTGF、FN和α-SMA的表达量，减轻肾脏中胶原纤维沉积，改善肾小球肥大及基底膜增厚现象，同时能够抑制肾脏MAPK和NF-κB信号通路。（2） RAP能够显著抑制高糖诱导下GMC细胞培养液中FN和COL4的表达，同时能够下调TGF-β1、CTGF、FN和α-SMA在mRNA和蛋白水平的表达。此外，RAP抑制GMC细胞中MAPK和NF-κB信号通路。 结论：多肽RAP能够通过抑制MAPK和NF-κB信号通路来改善STZ诱导的DN肾脏纤维化和高糖诱导的GMC细胞纤维化作用。

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