三种纳米粒子的小鼠急性眼毒性及生物安全性评估

摘要

纳米材料因其独特的理化性质，在医药、家电、纺织、电子工业、环保和机械等领域发挥着重要作用。但在纳米材料的生产、应用和排放等环节中都将不可避免地与释放到大气环境中，与人类及其他生物直接接触，造成潜在的生态生物健康风险。本论文着眼于纳米材料生物安全性，以实验室条件下制备的氧化石墨烯（graphene oxide，GO）、还原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，RGO）和聚乙二醇修饰的氮化硼（polyethylene glycol coated boron nitride，PEG-BNs）这三种结构高度相似的纳米粒子为受试材料，以昆明系小鼠（Kunming mice）为受攻试动物，通过眼表暴露、玻璃体腔暴露两种染毒方式，运用形态学、组织病理学和分子生物学等研究手段对上述三种纳米粒子的急性眼毒理效应及机制进行了研究和分析；此外，利用放射性同位素示踪法初步探讨了 PEG-BNs 在小鼠体内的代谢和分布，并结合组织病理变化及生理生化指标分析，对PEG-BNs 引起的小鼠全身毒性及辛伐他汀对 PEG-BNs 所致毒性的预防和治疗效果进行了评价。 1. 通过化学氧化还原法和化学修饰法分别制备GO、RGO和PEG-BNs，并利用透射电镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X 射线衍射（XRD）、拉曼光谱（Raman spectrum）和热重分析（TGA）等方法对其结构形态和组分进行表征。结果显示：通过化学氧化还原法，成功制备出粒度约为 100 nm的GO和RGO；其中，GO片层上富有含氧基团，主要为-OH和C=O，RGO不含含氧基团，但又被接入了新的N原子。由于大量含氧基团的存在，使得 GO层间距较RGO宽（GO层间距大致为0.707 nm，而RGO层间距缩短为0.335 nm），且 GO结构无序度较强，RGO结构较为有序（GO的IG/ID的值大约为1.21，RGO的IG/ID的值大约为 0.89）。利用 PEG化学修饰法，获得粒度约为20 nm的PEG-BNs，其中PEG质量比高达99.4%，体现出PEG的高修饰率，且PEG修饰后BNs的水溶性大幅提高但其原始结构并未受到影响。 2. 利用0.01 M的PBS溶液，将上述RGO、GO和PEG-BNs材料分别制备为三种不同浓度（25、50和100 μg/mL）的溶液/悬液。然后取10 μL直接暴露于麻醉后的小鼠右眼眼表（结膜囊内），每天一次，连续暴露 7天，以 PBS假处理作为对照。结果发现 GO 暴露组小鼠眼角膜均出现不同程度肉眼可见的不透明现象，且不透明程度随 GO浓度增加而加重，但三种浓度的RGO和 PEG-BNs均未对小鼠眼睛造成肉眼可见的明显损伤。以低浓度（25 μg/mL）GO连续暴露10天后，小鼠角膜不透明程度加重。对眼球进行病理学分析，发现GO暴露下的小鼠眼角膜病变明显，角膜基质层增厚，且层内细胞密度上升，眼内大量免疫细胞表达；TUNEL染色结果显示 GO暴露组眼球角膜基质层大量细胞凋亡。RGO 和 PEG-BNs 暴露组小鼠眼球组织未见明显病理变化。虹膜血管凝胶铸型结果显示，GO暴露组小鼠虹膜可见明显的新生血管，而RGO和PEG-BNs组虹膜血管无明显变化。GO 暴露组小鼠眼球炎症因子（TNF-α，IL-6，IL-8 和IL-10）表达水平的显著升高表明眼内炎症应答的发生，丙二醛（MDA）水平的升高则表明眼内脂质体发生氧化反应，而T-AOC水平提高提示小鼠眼球抗氧化机制被启动。为了研究 GO 能否进入小鼠眼睛内，取 GO 暴露的小鼠眼内容物进行强酸高温消化，取消化液直接进行TEM检测，在滤液中检测到GO片层，表明GO能够穿透角膜进入小鼠眼内。 3.将RGO，GO和PEG-BNs与0.01M的PBS分别制成浓度为25 μg/mL的溶液/悬液，取2 μL直接暴露于小鼠玻璃体腔内，PBS假处理作为对照。结果显示：GO暴露后1 d时，视网膜神经节细胞排布紊乱，出现细胞空泡样变，内核层、外网状层和外核层之间的层边界混乱不清晰，视杆视锥层和内网状层显著变薄，内核层和外网状层显著增厚；GO暴露后3 d时，视网膜神经节细胞排布较整齐，空泡样变细胞消失，内核层、外网状层和外核层之间的层边界较清晰，视杆视锥层、内网层、内核层和外网状层厚度均有所恢复，至GO暴露5 d后视网膜状态恢复到正常水平，暴露7 d后则稳定在正常水平。而RGO和PEG-BNs暴露后7 d内，视网膜病理切片未呈现任何明显可见的病变。另外，GO玻璃体腔暴露1 d后，MDA水平均有轻微高调，但变化不显著，3 d后呈现显著高调，5~7 d后稳定在正常水平；同时，相比对照组，T-AOC在GO暴露1 d后表达水平显著高调，3d时呈现极显著高调，5-7 d时稳定在正常水平，说明GO 暴露后短期内可导致眼内脂质体氧化，诱发启动眼内抗氧化机制。但 RGO和PEG-BNs玻璃体腔暴露后7 d内MDA和T-AOC均未呈现显著变化。证明GO暴露于玻璃体腔后，可造成短暂性可逆地视网膜损伤，RGO和PEG-BNs暴露于玻璃体腔后，无显著视网膜毒性。 4. 有上述可知，RGO和PEG-BNs表现出良好的眼部相容性，但与RGO相比，PEG-BNs 具有小尺寸、高溶解度等优点，因此对其体内急性毒性及毒性防治进一步进行探究。对小鼠行 PEG-BNs 尾静脉注射，利用同位素示踪法检测24 h内PEG-BNs在小鼠体内的代谢与分布。结果发现：PEG-BNs主要蓄积在肝、脾和肺中，在心脏和肾中也有少量积累。注射后1 h，PEG-BNs各脏器的分布量最大；随着时间推移，心脏、肺脏和脾脏中的PEG-BNs逐渐减少，血液、肝脏和肾脏中的PEG-BNs则呈现先减少后增加的趋势；但24 h后，所有脏器和血液中仍存在PEG-BNs残留。PEG-BNs注射24 h后小鼠血清中的生化指标（AST，ALT，TB，CREA，BUN 和 Cys-C）表达水平紊乱，脏器呈现明显的病理学损伤。进一步探讨小分子药物辛伐他汀（SST）对 PEG-BNs 生物毒性的防治效果，结果显示 SST 对 PEG-BNs的生物毒性呈现良好的治疗效果，但没有预防和协同缓解的作用。 通过本论文的研究，全面分析了GO、RGO和PEG-BNs三种纳米粒子的急性眼毒性，结果证明 RGO和 PEG-BNs具有良好的眼部相容性，有望作为新型纳米医疗材料应用于临床眼科，但 GO 直接接触眼睛可导致严重的眼部损伤，提示环境中 GO 纳米粒子含量上升的危害并警示我们注重眼睛保护。此外，我们首次对 PEG-BNs纳米粒子在机体内的代谢分布及毒性与毒性防治也做了初步探讨，为相关研究领域提供参考依据。

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