莪术醇对胆管癌细胞生长的抑制作用及其药靶的筛选与验证

摘要

目的：莪术醇具有强的肿瘤抑制作用，但其对胆管癌细胞的影响、作用机制及具体靶点尚不明确。本文拟通过莪术醇体外干预人胆管癌细胞，利用蛋白组学技术研究莪术醇对人胆管癌细胞生物学特性（细胞增殖、迁移、周期及凋亡）的影响及作用靶点，通过免疫组化实验验证药物靶点在胆管癌组织中的表达情况，通过慢病毒介导的基因沉默进行功能验证。 方法：以人胆管癌RBE、HCCC-9810细胞株及临床胆管癌组织标本为研究对象，采用CCK8法、细胞划痕实验分别检测不同浓度莪术醇对胆管癌细胞增殖、迁移的影响；流式细胞术检测经不同浓度莪术醇处理后的细胞周期分布及凋亡特征；利用双向电泳技术分析对照组及干预组的差异表达点，并利用MALDI-TOF/TOF质谱对差异蛋白进行分析，筛选出莪术醇抗胆管癌作用的潜在靶标CDKL3，并通过qRT-PCR及Western blot进行验证；通过构建慢病毒介导的CDKL3-shRNA，观察CDKL3下调对RBE细胞生物学行为的影响；通过IHC及qRT-PCR验证CDKL3在胆管癌组织中的表达情况。 结果： 在一定浓度范围内（50-100μg/ml）莪术醇能显著抑制人胆管癌细胞的增殖及迁移，并将胆管癌细胞周期阻滞在G1期，诱导细胞凋亡（P<0.01）。应用蛋白质组学技术筛选出对照组及实验组的差异表达蛋白并通过生物信息学分析筛选出CDKL3进行后续实验。qRT-PCR及Western blot证实莪术醇处理RBE细胞后CDKL3表达降低（P<0.01）。随后经CDKL3-shRNA慢病毒载体转染RBE细胞后，细胞的增殖、迁移能力显著降低，G1期细胞比例增加，凋亡率升高（P<0.01）。最后通过免疫组化及qRT-PCR证实胆管癌组织中CDKL3高表达（P<0.01）。 结论： 1. 莪术醇能显著抑制胆管癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力，并通过阻滞细胞分裂诱导其凋亡。CDKL3在胆管癌组织中的显著高表达，在胆管癌的发生发展中可能起重要作用，是莪术醇抗胆管癌治疗的潜在靶标。 2. CDKL3低表达能显著抑制胆管癌细胞的恶性表型（增殖、迁移及侵袭能力），并通过阻滞细胞周期诱导其凋亡。莪术醇可通过下调CDKL3抑制抗胆管癌细胞发生、发展。

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Abstract

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前言

第一部分 莪术醇对胆管癌细胞生物学行为的影响

1.1实验材料

1.1.1 实验试剂及耗材

1.1.2 主要实验仪器

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

1.2.2 CCK8法检测莪术醇对胆管癌细胞增殖的影响

1.2.3 划痕实验检测莪术醇对胆管癌细胞迁移的影响

1.2.4 流式细胞仪检测莪术醇对胆管癌细胞周期的影响

1.2.5 流式细胞仪检测莪术醇对胆管癌细胞凋亡率的影响

1.2.6 qRT-PCR分析莪术醇对G1期相关分子的影响

1.2.7 统计学分析

1.3 实验结果

1.3.1 莪术醇对胆管癌细胞增殖的影响

1.3.2 莪术醇对胆管癌细胞迁移的影响

1.3.3 莪术醇对胆管癌细胞周期的影响

1.3.4 莪术醇对胆管癌细胞凋亡的影响

1.3.5 莪术醇对胆管癌细胞周期G1期相关分子的影响

1.4 实验小结

第二部分 莪术醇抗胆管癌作用的蛋白质组学分析

2.1实验材料

2.1.1 组织标本

2.1.2 实验试剂及耗材

2.1.3 主要实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 应用双向电泳技术筛选差异表达蛋白

2.2.2 免疫组织化学、q-RT-PCR及Western blot验证CDKL3在胆管癌中的表达

2.2.3 统计学分析

2.3 实验结果

2.3.1 蛋白质组学方法筛选莪术醇作用RBE细胞后的差异表达蛋白

2.3.2 免疫组化、Western bolt、qRT-PCR验证CDKL3在胆管癌组织中的表达

2.4 实验小结

第三部分 CDKL3沉默对人胆管癌细胞生物学特性的影响

3.1 实验材料

3.1.1 主要试剂及材料

3.1.2 主要实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 qRT-PCR法检测CDKL3在三种细胞中的表达丰度

3.2.2 siRNA靶点设计及目的基因慢病毒载体构建

3.2.3 Western blot、qRT-PCR检测病毒转染效率

3.2.4 CCK8检测CDKL3沉默对RBE细胞增殖的影响

3.2.5 划痕实验检测CDKL3沉默对RBE细胞迁移的影响

3.2.6 流式细胞仪检测CDKL3沉默对RBE细胞周期的影响

3.2.7 流式细胞仪检测CDKL3沉默对RBE细胞凋亡的影响

3.2.8 Transwell实验检测CDKL3沉默对RBE细胞侵袭的影响

3.2.9 统计学分析

3.3 实验结果

3.3.1 CDKL3基因在胆管癌细胞中表达

3.3.2 CDKL3基因pFU-GW慢病毒载体构建

3.3.3 重组CDKL3-pFU-GW慢病毒成功转染 RBE 细胞

3.3.4 CDKL3基因沉默RBE细胞系mRNA和蛋白表达水平的变化

3.3.5 CDKL3基因沉默抑制RBE 细胞的增殖、迁移和侵袭

3.3.6 CDKL3基因沉默对RBE细胞周期及凋亡的影响

3.4实验小结

讨论

不足与展望

参考文献

综述

在学期间研究成果

致 谢