光合细菌Chromatium vinosum可溶性氢酶分离提纯、理化特性及基因克隆

摘要

氢酶(EC 1.12.-.-)是一类催化放氢与吸氢的酶.氢酶的研究不仅对揭示微生物的生 理代谢规律,而且对探索利用微生物生产能源氢有重要意义.光合细菌培养条件简单粗放,催化放氢的速率比蓝细菌高两个数量级,产氢的能量转化率及产生氢气的纯度较其它异养菌高,因而具有很好的研究价值和潜在的应用前景.该论文研究了C.vinosum可溶性氢酶分离 提纯的方法、理化特性及其小亚基基因的克隆,为对该酶的进一步研究及利用提供理论依据.该文研究结果表明,C.vinosum可溶性氢酶是一种新的NiFe-氢酶,该酶由52kDa和21.5kDa两个亚基组成.可溶性氢酶与膜结合态氢酶的理化特性存在很大差异.可溶性氢酶活性中心的结构类似于其它NiFe-氢酶,但该酶不含[4Fe-4S].

目录

文摘

英文文摘

一、前言

(一)氢酶的生理功能

(二)氢酶的纯化与性质

(三)氢酶的结构与催化机理

(四)氢酶基因及其结构

(五)本论文的研究内容

二、材料与方法

(一)实验材料

(二)实验方法

1.菌体培养

2.可溶性氢酶的小批量分离提纯

3.可溶性氢酶的大批量分离提纯

4.可溶性氢酶活性的测定

5.蛋白质浓度的测定

6.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及染色

7.可溶性氢酶大、小亚基分子量及N-末端氨基酸序列测定

8.可溶性氢酶理化特性的测定

9.可溶性氢酶的电子顺磁共振波谱(EPR)测定

10.可溶性氢酶的红外光谱(FTIR)测定

11.可溶性氢酶小亚基基因的克隆

12.克隆子的鉴定和序列分析

三、结果与分析

(一)培养基中Se对可溶性氢酶产量的影响

(二)可溶性氢酶的分离与纯化

1.可溶性氢酶的小批量分离提纯

2.可溶性氢酶的大批量分离提纯

(三)可溶性氢酶的一般特性

1.可溶性氢酶的亚基组成及分子量

2.温度、pH对可溶性氢酶活性的影响

3.可溶性氢酶利用不同氧还电子载体的催化特性

4.CO对可溶性氢酶的抑制作用

5.可溶性氢酶对胰蛋白酶的稳定性

6.可溶性氢酶大、小亚基N-末端氨基酸序列

(四)可溶性氢酶的波谱特性

1.可溶性氢酶的EPR谱特性

2.可溶性氢酶的FTIR谱特性

(五)可溶性氢酶小亚基基因的克隆与测序

1.含可溶性氢酶小亚基基因片段的扩增

2.含可溶性氢酶小亚基基因的重组质粒的构建

3.克隆子重组质粒pCVS分析

4.pCVS外源插入片段序列分析

四、讨论与结论

(一)影响可溶性氢酶分离纯化的主要因素

(二)可溶性氢酶理化特性分析

(三)可溶性氢酶波谱特性分析

(四)可溶性氢酶小亚基基因结构及特点

(五)结论与展望

参考文献

致谢

附录