多元核-壳型荧光纳米生物标记物的制备与应用及噬菌体介导的新型免疫-PCR体系的建立

摘要

本论文主要围绕超高灵敏免疫诊断新技术开展研究工作。时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)以及免疫-PCR技术是现代免疫分析方法中两个极为引人注目的热点领域，特别适合于临床上极微量抗原、抗体的检测及病原微生物痕量检测等。本论文选题于这两个研究方向，并开展相关的研究工作。全文主要包括三个部分：综述了各种类型的高灵敏免疫检测技术；新型稀土螯合剂2，9-双［N，N-双(羧甲基)氨甲基]-1，10-(菲咯啉){BBCAP}的合成及多元核-壳型荧光纳米生物标记物的制备；天然噬菌体介导的免疫-PCR模型的建立。 第一章为绪论，介绍了各种类型的高灵敏免疫检测技术，并简要介绍高灵敏检测技术发展的最新成果。 第二章主要为稀土螯合剂BBCAP的合成及多元核壳型荧光纳米标记物的制备、表征及应用。首先合成了一种新型稀土螯合剂BBCAP，该螯合剂具有良好的水溶性，即可与铕(Eu)、铽(Tb)等稀土金属离子形成强荧光络合物，不需要加入增强液，且与稀土离子所形成的络合物荧光强度十分稳定。将纳米荧光材料制备技术与时间分辨荧光免疫测定法相结合，建立了以荧光纳米颗粒为生物标记物的高灵敏度时间分辨荧光免疫分析方法。稀土螯合剂BBCAP与3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)室温搅拌下反应2h，合成功能化APTMS-BBCAP复合体，可以与Eu(Ⅲ)、Tb(Ⅲ)进行螯合，形成了APTMS-BBCAP-Eu(Ⅲ)/Tb(Ⅲ)前躯体。将前躯体加入到油包水型(W/O)微乳液体系，通过优化乳液中各组分的配比和氨水的量来控制纳米颗粒的大小和四乙氧基硅烷的水合化、聚合速度，得到了直径在35-55nm之间的硅胶包裹稀土络合物荧光纳米颗粒，该荧光纳米颗粒具有较好的分散性，光谱性质与前驱体基本相同，但其抗光漂白能力要高于前驱体，更远高于有机荧光染料。控制Tb(Ⅲ)及Eu(Ⅲ)二者之间的比例，制备出一系列多元核-壳型荧光纳米颗粒，配合紫外灯及合适的滤光片可以分辨出从绿光到红光间一系列的颜色差异。多元型核-壳荧光纳米颗粒能够方便地引入氨基、巯基、环氧基活性基团等，经过表面修饰后的荧光纳米颗粒，可以与抗体、抗原、寡核糖核苷酸等生物大分子交联。这种多元核-壳型荧光纳米作为生物标记物在免疫分析，细胞成像及DNA杂化等领域将具有广阔的应用空间。我们选取了其中一种Tb(Ⅲ)纳米颗粒，采用“三明治”夹心法对人血清中乙肝表面抗原(HBsAg)进行了检测，以空白的3倍相对偏差除以工作曲线的斜率得出本体系检测限为35 pg/ml(3σ/s)。免疫分析应用结果表明核.壳型荧光纳米作为一种生物标记物用于时间分辨荧光生物分析具有进一步深入研究的价值。 第三章描述了新型免疫PCR体系的建立及评价。选取具有天然纳米结构的双链DNA噬菌体T7，通过异型双功能交联剂Sulfo-SMCC活化，使其形成具有巯基反应活性的T7噬菌体。抗HBsAg抗体可经Traut's Reagent引进巯基，形成巯基化抗体。二者交联，经超滤纯化，得到了T7噬菌体表面带有抗体分子的T7-Antibody复合物。以此作为检测探针，初步建立了一种超灵敏的免疫-PCR体系。通过采用1％戊二醛处理聚丙烯PCR管，使得免疫反应和PCR反应能在同一管进行。实验结果表明，HBsAg在1000 ng/ml-0.01 ng/ml范围内呈现良好的线性关系(R=0.98)，检测限达到0.1 pg/ml。实验检测了29份阳性血清和45份阴性血清，其结果与ELISA结果吻合。结果证实了该噬菌体介导的免疫PCR检测具有可行性和应用价值。

目录

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摘要

第一章绪论

§1.1课题研究的背景及意义

§1.2超灵敏检测技术发展状况

§1.2.1胶体金-银免疫分析技术

§1.2.2复合型荧光纳米标记物免疫分析技术

§1.2.3时间分辨免疫分析技术

§1.2.4免疫PCR技术

§1.2.5其他类型的超灵敏检测技术

§1.3本论文研究内容

参考文献

第二章多元核-壳型荧光纳米颗粒的制备，表征及其在时间分辨免疫分析中的应用

第一节引言

第二节稀土螫合剂BBCAP的合成

§2.1材料与方法

§2.2 BBCAP的表征

第三节核-壳型荧光纳米颗粒的制备及表征

§3.1材料与方法

§3.2实验结果

第四节讨论

参考文献

第三章噬菌体介导的新型免疫PCR体系的初步建立

第一节引言

第二节材料和方法

§2.1 T7噬菌体的扩增

§2.2 T7噬菌体的纯化

§2.3 T7噬菌体表面游离氨基的确认及氨基数目的估算

§2.4 T7噬菌体表面功能基团的衍生化

§2.5抗体的巯基活化

§2.6噬菌体-抗体复合物的的制备及纯化

§2.7 PCR管功能化

§2.8引物及探针的设计

§2.9基于噬菌体-抗体复合物的免疫PCR

第三节实验结果

§3.1 T7噬菌体表面氨基基团的验证及数目，浓度估算方法

§3.2噬菌体-抗体复合物透射电镜观察

§3.3引物的筛选

§3.4实验条件的优化

§3.5普通免疫PCR灵敏度实验

§3.6实时免疫PCR检测HBsAg线性范围考察

§3.7实时免疫PCR检测HBsAg的检测限

§3.8血清样品的检测及结果分析

第四节讨论

参考文献

附录Ⅰ:硕士期间发表论文