对虾养殖环境微生物多样性分析和微生态制剂的研究与应用

摘要

本论文针对水产养殖现行使用的微生物制剂作用时效短，在使用过程中优势地位不明显等缺陷，基于微生态理论和芽孢杆菌作为微生态制剂的优良特性，从对虾养殖环境获得一批产芽孢细菌，并加以鉴定；以胞外消化酶为指标分离筛选可高效降解水产养殖残余饵料淀粉、蛋白及脂肪作用的若干株产芽孢功能菌，通过酶活性测定，确定一株地衣芽孢杆菌S一40作为潜在益生菌进行了对虾养殖实验；研究了对虾养殖环境的细菌群落组成，主要研究结果如下： 1.构建了对虾养殖环境细菌16s rDNA文库，研究其细菌群落组成。结果表明：对虾肠道细菌分属于变形细菌(Proteobacterial)和厚壁菌类群(Firmicute)，Proteobacteria占据了绝对优势，为98.7％，其中γ-Proteobacteria为97.4％；养殖水体菌群主要由变形细菌(24.1％)和拟杆菌门(17.7％)组成，其中α-Proteobacteria所占比例为21.5％；养殖环境表层沉积物的细菌多样性要丰富得多，有变形细菌(52.3％)，拟杆菌门(Bacteroidetes，9.3％)，浮霉状菌(Planctomycete，4.7％)，厚壁菌类群(Firmicute，1.9％)和放线菌门(Actinobacteria，0.9％)。此外，水样和沉积物中蕴含着数量丰富的单细胞藻类，它们的比例分别高达55.7％和23.4％。 2.从对虾养殖环境(对虾肠道和虾池表层沉积物)分离筛选出191株产芽孢细菌，细胞形态和RFLP分型后，对其中70株菌进行了生理生化以及分子生物学方法鉴定。结果显示它们分属于短芽孢杆菌属(2株)、芽孢乳杆菌属(2株)、类芽孢杆菌属(4株)和芽孢杆菌属(44株)。其中芽孢杆菌属中，我们鉴定得到13个种，包括环状芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、花园芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、泛酸芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，坚强芽孢杆菌、纺锤芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。 3.利用选择性培养基，从前期工作得到的产芽孢细菌中分别筛选出9株具有较高淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性的菌株，对其发酵条件以及粗酶液性质进行了初步的研究。结果表明多株菌在一定的温度、pH及盐度区间内均有较强的酶活力，一株地衣芽孢杆菌S-40由于其良好而稳定的消化酶活性，作为养殖水体添加剂进行对虾养殖实验。 4.应用从对虾养殖环境筛选的一株地衣芽孢杆菌S-40，作为潜在的微生态制剂菌株，分别以103 cfu/mL，104 cfu/mL，105 cfu/mL三种不同浓度添加到凡纳滨对虾养殖水体中，测定了饲养40天后对虾消化道的总菌和弧菌数及多项免疫指标。结果显示：与对照组对虾相比，所有实验组对虾消化道的弧菌数有显著下降，而总菌数没有呈现显著性差异；所有实验组中对虾血淋巴上清液的血细胞数，酚氧化酶活性(PO)均有显著性上升，超氧化物歧化酶(SOD)仅在105 cfu/ml时有显著上升，菌剂的加入对对虾血淋巴上清液的的蛋白浓度并无显著影响。 5.本研究选用微孔淀粉为吸附剂吸附地衣芽孢杆菌S-40菌株芽孢，通过多因素分析，确定最佳的吸附包埋条件：pH 7.5，温度30℃，吸附时间1.5 h。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1对虾养殖业现状

1.2养殖系统脆弱性的根源

1.2.1养殖池生态结构的特殊性

1.2.2养殖生态环境的污染

1.2.3养殖生态环境污染的结果

1.3养殖生态系统的微生态调控

1.3.1微生物在养殖生态系统中的地位和作用

1.3.2养殖生态环境微生物多样性研究的意义及现状

1.3.3养殖环境的微生态调控措施

1.4微生态制剂在水产养殖中的应用及作用原理

1.4.1水产微生态制剂的定义

1.4.2微生态制剂在水产养殖中的应用

1.4.3微生态制剂的作用机理

1.5微生态制剂候选菌株存在的缺陷与展望

1.6本研究工作的意义及研究思路

第二章对虾养殖环境微生物多样性分析

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果与分析

2.3.1对虾养殖环境样品16srDNA文库的构建

2.3.2对虾养殖环境微生物多样性分析

2.4讨论

第三章对虾养殖环境中产芽孢细菌的分离与鉴定

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果与分析

3.3.1细菌平板计数结果

3.3.2菌株鉴定结果

3.4.讨论

第四章对虾养殖环境中产芽孢细菌的消化酶活性分析

4.1引言

4.2材料与方法

4.3结果与分析

4.3.1产淀粉酶菌株的初筛

4.3.2产脂肪酶菌株的初筛

4.3.3产蛋白酶菌株的初筛

4.3.4不同发酵条件对菌株产淀粉酶的影响

4.3.5不同发酵条件对菌株产蛋白酶的影响

4.3.6不同发酵条件对菌株产生脂肪酶活的影响

4.4.讨论

第五章地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道菌群和免疫机能的影响

5.1引言

5.2材料与方法

5.3结果与分析

5.3.1地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道细菌数量的影响

5.3.2地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾血细胞数的影响

5.3.3地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾血淋巴上清总蛋白的影响

5.3.4地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾血淋巴上清PO活性的影响

5.3.5地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾血淋巴上清SOD活性的影响

5.4.讨论

第六章地衣芽孢杆菌的微胶囊化实验研究

6.1引言

6.2材料与方法

6.3结果与分析

6.3.1保护剂对吸附效果的影响

6.3.2 pH对吸附效果的影响

6.3.3温度对吸附效果的影响

6.3.4时间对吸附效果的影响

6.4.讨论

第七章结论与展望

7.1结论

7.2本论文创新点

7.3展望

参考文献

附 录

致谢