VP466-Rab-tropomyosin-actin复合体在对虾免疫以及白斑综合症病毒(WSSV)感染过程中的作用研究

摘要

对虾白斑综合症病毒(WSSV)，是一种严重危害对虾养殖业的主要病原。本文从病原和宿主两方面入手，着重探讨了WSSV病毒的主要膜蛋白VP466与对虾体内蛋白Rab、原肌球蛋白以及肌动蛋白之间形成的复合体在对虾的免疫和病毒的感染过程中的所起的重要作用，不仅为在宿主体内寻找病毒膜蛋白受体提供了理论基础而且为建立有效的防治方法提供了科学依据。 本文首先证明了VP466-Rab-tropomyosin-actin是一个复合体。根据GST-pulldown、质谱的结果，发现Rab蛋白与对虾白斑综合症病毒的膜蛋白VP466、肌动蛋白(actin)、原肌球蛋白(tropomyosin)之间存在互作。采用共转染昆虫细胞、免疫共沉淀、Western分析等方法，在体内和体外都证明了病毒的膜蛋白VP466和Rab、tropomyosin以及actin之间确实存在互作，并且也进一步验证了VP466与Rab、tropomyosin蛋白的互作片段，结果发现VP466的C-端既可以与Rab蛋白也可以与tropomyosin蛋白互作，并且都是在同一区域。其次是对VP466-Rab-tropomyosin-actin这个复合体的功能开展研究。研究发现，其一，VP466蛋白通过与Rab蛋白以及actin之间的结合在宿主本身的免疫反应中有重要作用。当RNAi抑制Rab基因表达，血细胞吞噬活性减弱，病毒拷贝数上升；体外注射mRNA使Rab基因表达上调时，结果血细胞吞噬活性增强，病毒拷贝数下降。体外体内试验证明，VP466蛋白可以促进Rab GTPase酶活升高。因此，宿主对病毒免疫反应的一条可能途径是，细胞内Rab蛋白识别病毒膜蛋白VP466，与其结合后酶活升高，促进actin向有利于吞噬的反方向发生变构，从而提高血细胞的吞噬病毒的能力，导致病毒拷贝数的降低。其二，VP466蛋白通过与tropomyosin以及actin之间的结合有利于病毒自身的感染。采用RNAi抑制VP466基因表达时，通过Real—time PCR．分析发现病毒的拷贝数是下降的，说明了VP466蛋白在WSSV病毒的感染过程中起重要作用。采用RNAi抑制tropomyosin基因表达时，通过Real—timePCR、病毒的半定量PCR分析发现病毒的拷贝数是下降的。因此，病毒感染的一条可能途径是，病毒膜蛋白VP466与细胞骨架蛋白tropomyosin蛋白及actin之间结合，通过骨架蛋白的运动，有利于病毒自身的感染。其三，通过缺失突变发现，VP466与Rab和tropomyosin结合的位点在同一结构区域内，推测它们的结合是一种竞争关系，这种竞争会影响到VP466是与tropomyosin结合而促进病毒自身的感染，还是和Rab结合促进宿主的免疫反应。总之，我们的研究结果首次发现了WSSV病毒的膜蛋白VP466是一个双功能蛋白，与宿主的不同蛋白结合后，可在宿主免疫或病毒感染中起作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1对虾白斑综合症病毒研究进展

1.1.1对虾白斑综合症病毒的一般特征

1.1.2病毒的基因组结构

1.1.3病毒的结构蛋白基因

1.2对虾的免疫系统

1.2.1 虾类免疫应答机制

1.2.2器官免疫

1.2.3对虾的细胞性免疫和体液性免疫

1.3 RNA干扰作用机制及其应用

1.3.1 RNA干扰作用的机制

1.3.2 RNA干涉技术的应用

1.4本论文研究的目的及意义

2材料与方法

2.1.材料

2.1.1日本对虾

2.1.2昆虫细胞、菌株和质粒

2.1.3试剂盒

2.1.4酶类及抗生素

2.1.5其他试剂

2.1.6主要仪器

2.1.7引物合成：均由上海生工生物技术公司合成。

2.1.8常用溶液和培养基的配置

2.2方法

2.2.1 VP466-Rab-tropomyosin-actin复合体之间的相互作用

2.2.2 VP466蛋白对Rab GTPase酶活的影响

2.2.3 RNAi验证VP466-Rab-tropomyosin-actin复合体在宿主免疫及病毒感染中的作用

2.2.4体外注射mRNA试验

3结果与分析

3.1 WSSV的病毒膜蛋白VP466与对虾体内蛋白的互作分析

3.1.1 WSSV病毒膜蛋白VP466与Rab蛋白互作分析

3.1.2 WSSV病毒膜蛋白VP466与tropomyosin的蛋白互作分析

3.1.3对虾Rab及VP466与β-actin的互作分析

3.2 VP466-Rab-tropomyosin-actin复合体在对虾的抗病毒免疫中的作用

3.2.1 WSSV的病毒膜蛋白VP466对Rab GTPase的影响

3.2.2 WSSV的病毒膜蛋白VP466与Rab互作片段的分析

3.2.3对虾Rab GTPase对血细胞吞噬功能的影响

3.2.4 RNAi抑制Rab基因的表达对WSSV病毒拷贝数的影响

3.3 VP466-Rab-tropomyosin-actin复合体在病毒感染过程中的作用

3.3.1 RNAi抑制VP466基因的表达对WSSV病毒拷贝数的影响

3.3.2 RNAi抑制tropomyosin基因的表达对WSSV病毒拷贝数的影响

3.3.3 WSSV的病毒膜蛋白VP466与同tropomyosin互作片段的分析

4讨论

5结论与展望

参考文献

附录

致谢