维甲酸对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的诱导分化作用及其机理研究

摘要

本文在鉴定维甲酸(RA)诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞终末分化基础上，应用蛋白质组学分析技术，对SK-N-SH细胞诱导分化过程中细胞蛋白质组变化进行初步研究。分析鉴定与神经母细胞瘤细胞增殖分化相关的特异性蛋白，并探索它们在神经母细胞瘤细胞诱导分化过程中的调控作用，以期能够在较为整体水平上进一步认识细胞癌变与逆转机理问题，从而找出细胞增殖与分化调控研究的新方向。 实验结果显示，经1μmol/L RA处理之后，人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的增殖受到抑制，细胞生长抑制率达36.16％；细胞周期发生了 Go/G1期阻滞；光镜与电镜观察结果显示，RA处理后SK-N-SH细胞形态和超微结构发生恢复性变化，产生了细胞呈极性状、伸出多个轴突树突状突起、细胞逐渐变小变圆并融合在一起形成类似神经节样结构、细胞表面微绒毛减少、核仁变少变小、常染色质增多、细胞器丰富发达等显著变化；免疫细胞化学检测显示RA处理后SK-N-SH细胞癌基因c-myc、c-fos的表达下调而抑癌基因p53、p27的表达上调，并进一步促使SK-N-SH细胞NSE、MAP2、Synaptophysin等神经元特异性标志物的表达。双向凝胶电泳分析显示在RA诱导SK-N-SH细胞分化前后存在26个差异表达蛋白点，质谱分析鉴定了其中16个蛋白，其中表达上调的蛋白点有：Rab GDP dissociationinhibitor，RABGAP1L protein(RAB GTPase activating protein l-like),DNM1L protein，SP110，Myoneurin，DNA topoisomeraseⅡ binding protein，Human iroquois-classhomeodomain protein IRX-5和Alpha-enolase，而BCL2/adenovirus E1B19kDainteracting protein1(BNIP1)和PHD finger protein20-like1为新出现的蛋白点；表达下调的蛋白为cell division cycle73，interleukin-8，RAB37，Methyltransferase(DNMT)和Vav3 oncogene protein，而HP protein为诱导处理后消失的蛋白点。获得鉴定的16个蛋白包括基因表达调控因子、肿瘤相关基因表达产物、神经细胞功能性蛋白、DNA损伤修复蛋白等，其中DNM1L、Myoneurin、IRX-5首次发现与细胞的癌变和分化相关，而PHD finger、SP110、IRX-5首次发现与神经细胞分化、神经母细胞瘤分化相关。 研究结果表明，1μmol/L RA对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞具有显著的诱导分化作用，通过抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、调控癌基因和抑癌基因表达以及促进分化相关标志物表达促进细胞分化。在SK—N—SH细胞分化的同时，细胞蛋白质组成也相应发生明显变化，差异表达蛋白包括基因表达调控因子、肿瘤相关基因表达产物以及神经细胞功能性蛋白等，在神经母细胞瘤分化过程中的有重要作用。