日本囊对虾黏着斑激酶和ADP核糖基化因子的研究

摘要

本研究论文对日本囊对虾的黏着斑激酶(MjFAK)及小G蛋白ADP核糖基化因子(MjArf4)进行了初步研究，同时建立一套有效的噬菌体展示库筛选方法以寻找与它们相互作用的蛋白，为今后研究MjFAK及小G蛋白在WSSV感染中的信号转导机制奠定基础。 FAK是一类非受体酪氨酸激酶，在高等生物中已经被广泛报道参与细胞的粘附、抗凋亡、actin重组以及肿瘤的发生。我们首次在甲壳纲动物中克隆到FAK。序列分析发现MjFAK中间含有保守的PTK结构域和C端的FAT结构域。MjFAK的Tyr399，Tyr579被证实发生磷酸化。另外，在WSSV病毒感染日本囊对虾的早期，其血细胞MjFAK蛋白的表达水平上调，引起MjFAK(pY399)和MjFAK(pY579)水平的上升。研究感染病毒的血细胞对Fn(Fibronectin)的粘附情况还发现，血细胞对Fn的粘附与MjFAK磷酸化水平相关。因此，我们推断对虾血细胞MiFAK在病毒入侵及宿主防御中都扮演重要角色。 Arfs属于Ras家族的小G蛋白，我们从日本囊对虾中克隆一个属于ClassⅡ的Arf(命名为MjArf4)。研究发现，WSSV感染72 h后，MjArf4的表达水平显著上升，提示MjArf4与病毒感染有着密切联系。进一步研究发现在MjArf4启动子-18 bp处含有一个保守的CRE(cAMP response elemem)，启动子活性分析表明该CRE在转录调控中可能有抑制MjArf4转录的作用。将MjArf4转染入High Five昆虫细胞发现，MjArf4可能定位在高尔基体中，活性突变分析表明MjArf4的分布是GTP依赖性的。体外病毒吞噬实验发现BFA并不影响血细胞对病毒的吞噬。这些结果表明MjArf4在WSSV感染后期发挥着重要作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1 对虾的养殖现状

2 对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)

3 对虾的免疫系统

3.1细胞免疫

3.2体液免疫

4 噬菌体展示技术(phage-display technology)

5黏着斑激酶(Focal Adhesion Kinase，FAK)

6 ADP核糖基化因子(ADP ribosylation factor,Arf)

7 本论文研究的内容、目的和意义

第一章 日本囊对虾黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)在WSSV感染中的应答

1材料和方法

2结果

2.1MjFA全长cDNA序列的克隆

2.2 MjFAK的结构分析

2.3MjFAK的组织表达图谱

2.4 MjFAK/C的原核表达纯化

2.5 MjFAK多克隆抗体的制备

2.6 MjFAK的磷酸化

2.7 MjFAK及其磷酸化在血细胞中的分布

2.8 MjFAK及其磷酸化在病毒感染后的变化

2.9血细胞粘附(Hemocyte Adhesion)与病毒感染的关系

3讨论

4小结与展望

第二章 日本囊对虾核糖基化因子(ADP ribosylation factor,Arf)的功能和表达调控的研究

1材料和方法

2结果

2.1 MjArf4全长cDNA克隆

2.2 Real time PCR分析MjArf4在病毒胁迫后的表达水平

2.3 MjArf4的启动子的扩增

2.4 MjArf4的启动子分析

2.5 MjArf4的启动子活性的验证

2.6 MjArf4在细胞中的定位及突变分析

2.7 BFA对血细胞吞噬WSSV的影响

3讨论

4小结与展望

第三章 日本囊对虾肝胰腺cDNA噬菌体展示文库的筛选

1材料与方法

2常用试剂和培养基配制

3结果

3.1噬菌体展示文库筛选靶蛋白的纯化

3.2噬菌体展示库筛选

4讨论

5小结和展望

参考文献

附录

致谢