基于中心重合引物的PCR诱变技术新进展

摘要

基于PCR的体外诱变法发展至今，使用的引物从重组PCR法(Recombination PCR)的至少4条引物到大引物PCR法(Megaprimer PCR)的3条引物，再到Quikchange快速突变法(QuikChange Mutagenesis PCR)的2条引物。从至少3轮PCR反应发展到只需2轮，到Quikchange法及反向PCR法(Inverse PCR)的仅使用一轮PCR反应，步骤越来越简单，操作越来越简便，为使用PCR技术进行各种基因克隆操作的科学工作者节省了大量的时间和精力。 近几年，有文献报道使用基于Quikchange原理的方法来制作DNA片段的插入、替代以及删除突变，但由于QCM-PCR的低产量，难以产生阳性克隆。而采用末端相对的(tail-to-tail)引物设计方法的反向PCR则需要用连接酶连接PCR扩增产物，操作麻烦且阳性率也偏低。 我们实验室一直在寻找一种简单高效的可以用于基因的删除、插入及替代突变的方法，通过大量研究和实验发现，可以使用一种基于反向PCR原理，使用全新的引物设计的突变方法--“COP”突变法，该方法采用与QuikChange点突变法相同的操作步骤，其策略是设计一对中心重合(Central overlap)的引物，长引物的5’端序列和3’端序列的Tm值均不低于66℃，短引物Tm值约为长引物一半，且与长引物中心重合互补。这种方法能用于超过20bp的碱基的插入或替代突变，及用于超过2000bp DNA片段的删除突变的研究。 这种方法引物设计极为简单，能快速构建突变质粒，可以用于多点突变，删除，替代，插入等多种基因克隆操作，有85％以上的阳性产率。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语对照表

声明

1 前言

1.1重组PCR诱变法

1.1.1用重组PCR做定点突变

1.1.2重叠延伸PCR技术

1.2 大引物PCR(Megapr imer POR)进行基因突变

1.2.1 Megaprimet PCR法进行单碱基突变

1.2.2 Megaprimet PCR法进行删除和插入突变

1.3 Quikchange快速突变法及反向PCR法

1.3.1 Quikchange法快速制备点突变

1.3.2反向PCR突变方案

1.4 本文研究的目标、内容和意义

2材料与方法

2.1 实验药品、试剂与仪器

2.2 实验方法

3结果与分析

3.1 基于Quikohange原理的改进型突变方法——COP法

3.1.1 COP法引物设计的优化

3.1.2 COP突变法的条件优化

3.2 COP法做删除突变的阳性率及该方法的实际应用

3.2.1 COP法做删除突变的阳性率

3.2.2 COP法删除HIV-1 LTR启动子的顺式元件及转录因子结合位点

3.2.3一些用于COP删除法的引物列表

3.3 COP法用于插入和替代突变(多点突变)的研究

3.3.1 COP法用于插入或替代突变的引物设计方案

3.3.2 COP法用于插入或替代突变(多点突变)的产物阳性率

4讨论与结论

5参考文献

致谢