轮状病毒结构蛋白在大肠杆菌中的表达及其类病毒颗粒的体外组装

摘要

A组轮状病毒是引起婴幼儿严重腹泻的主要病原体，几乎所有儿童在5岁前至少感染过一次轮状病毒，每年因感染轮状病毒而导致的婴幼儿腹泻高达2亿，住院人数超过200万，死亡高达100万人，仅在美国，每年因轮状病毒而产生的医疗费用就高达1亿美元。 自1973年轮状病毒在人体发现以来，各国科研人员对其进行了大量的研究，对其结构和感染机制的研究日益深入，但到目前为止，尚无针对轮状病毒的特效药物，因此，快速、准确的诊断和安全、有效的疫苗对控制轮状病毒的感染极其重要。病毒样颗粒(Virus-Like Particles， VLPs)作为轮状病毒的候选疫苗具有广阔的发展前景，对进一步研究轮状病毒的感染机制和组装机制也具有重要的意义。 我们在大肠杆菌中表达了轮状病毒的结构蛋白VP2，首次在体外成功的组装了轮状病毒核心样颗粒(Core-like Particle， CLP)并初步研究了环境因素对其稳定性的影响，为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础；通过缺失突变研究了VP6的自身相互作用的区域，发现243-334aa为VP6形成三聚体的最小区域，通过定点突变研究了半胱氨酸在VP6聚体形成中的作用并通过免疫印迹研究了缺失突变和定点突变对VP6免疫反应性的影响，通过同源建模构建了VP6的结构并分析了定点突变对VP6结构的影响；构建了VP4和VP7的表达质粒；此外，还制备了轮状病毒的单克隆抗体，初步实验证实7H11、2A9和5C2具有较好的广谱性和特异性。该研究为轮状病毒VLP的体外组装及VLP疫苗的研究奠定了基础，对进一步研究轮状病毒的感染机制和组装机制也具有重要的意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 前言

1.轮状病毒的结构

1.1.轮状病毒的核心

1.2.轮状病毒的内衣壳

1.3.轮状病毒的外衣壳

2.轮状病毒非结构蛋白

3.轮状病毒的流行病学

4.轮状病毒感染的动物研究模型

5.轮状病毒的感染与免疫

6.轮状病毒的预防与控制

6.1.轮状病毒检测试剂的发展

6.2.轮状病毒疫苗的发展

7.本研究的目的与意义

8.主要研究内容

第二部分：材料和方法

1.材料

1.1.主要仪器

1.2.主要试剂和材料

1.3.常用溶液和培养基的配制

2.方法

2.1.分子克隆

2.2.SDS-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2.3.蛋白的表达与纯化

2.4.蛋白复性方法

2.5.VLP的体外组装

2.6.免疫印迹法(Western Blotting)

2.7.酶联免疫吸附实验(ELISA)：间接法

2.8.计算机辅助分析与设计

2.9.单克隆抗体的制备

第三部分 结果与分析

1.轮状病毒基因的获取

1.1 引物设计

1.2 RNA提取与扩增

2.轮状病毒核心蛋白VP2的原核表达及其CLP的组装

2.1 VP2的克隆

2.2 VP2表达质粒的构建与鉴定

2.3 VP2的大量表达与纯化

2.4 VP2 CLP的体外组装

2.5 VP2及其CLP的稳定性的研究

3.VP6的表达、纯化及性质的初步研究

3.1 VP6基因的克隆

3.2 VP6表达质粒的构建与鉴定

3.3 VP6的表达、纯化

3.4 VP6的免疫反应性

3.5 VP6的结构模拟与分析

4.VP4和VP7克隆和表达质粒的构建

5.RV结构蛋白单抗的制备及VP6单抗在轮状病毒检测中的初步应用

5.1 RV单克隆抗体的制备与鉴定

5.2 VP6单克隆抗体在轮状病毒检测中的初步应用

第四部分 讨论

1.轮状病毒疫苗研究现状及发展趋势

2.RV结构蛋白在原核表达系统的表达与纯化

3.CLP的体外组装

4.VP6的结构与组装

5.VP6单克隆抗体的制备与应用

第五部分总结与展望

参考文献

致谢