磷酸腺苷调节HSP70与底物作用的机制/RKIP与突变体的稳定性研究

摘要

热休克蛋白是细胞受热等因素刺激后诱导产生的应激蛋白质,是在生物进化中高度保守的蛋白质分子家族,广泛存在于从原核到真核各种生物细胞内；后来研究证明热休克蛋白在正常生理条件下亦表达并起重要作用,其作为分子伴侣参与未折叠新生多肽链、多蛋白复合物的组装和跨膜运输、转位、蛋白质降解、细胞内蛋白质合成后的加工等一系列重要生物活动,维持细胞正常的生命活动。
　　 在进化过程中细胞建立了由再折叠途径与降解途径组成的蛋白质质量控制(protein quality control)系统。作为蛋白质质量控制系统的核心,HSP70在正常和应激条件下都具有识别非天然蛋白的能力,可识别暴露于变性蛋白或短肽表面的疏水性区域,协助它们进行重新折叠,或者将无法恢复的蛋白质转移给蛋白质降解系统,使之降解。HSP70蛋白家族具有一个共同的三级结构:N端高度保守ATPase功能域和C端底物结合功能域。HSP70功能发挥依赖于ATP的水解,ATP或ADP的结合与解离调控底物蛋白的结合和释放。
　　 本实验采用HSP70的典型底物,同时结合HSP70磷酸腺苷结合缺失突变体HSP70K71A、T204A、H227S考察磷酸腺苷对HSP70功能的调控作用。
　　 我们以变性萤光素酶作为复性实验底物来检测HSP70的分子伴侣功能。发现HSP70K71A、T204A突变体体外帮助变性荧光素酶的重折叠功能受到抑制,而H227S突变体的体外帮助变性荧光素酶的重折叠功能比野生型HSP70稍有降低。ADP部分抑制了野生型HSP70对变性荧光素酶的重折叠,但是对第二个金属结合位点的H227S突变体的重折叠功能没有影响,进一步证实第二个金属结合位点可能与ADP结合相关。
　　 用萤光标记的NR短肽考察磷酸腺苷影响HSP70与底物结合的动力学过程。发现HSP70与K71A突变体动力学过程比较相似,而磷酸腺苷对H227S突变体与NR短肽结合并没有很大的影响。
　　 用ITC滴定考察磷酸腺苷如何调节辅助分子伴侣CHIP蛋白与HSP70的相互作用。发现ATP可以直接与HSP70相互作用,但CHIP蛋白必须在有ATP的条件下方可与HSP70结合。
　　 我们的实验结果说明ADP结合位点突变主要影响HSP70帮助变性蛋白的复性功能,不影响变性蛋白降解过程。本研究对于理解细胞蛋白质质量控制系统的调控机制,以及癌症、老年痴呆症的发病机理都有潜在价值。