琼脂糖液滴微流控及其在高通量单分子/单细胞分析中的应用

摘要

液滴PCR(Droplet PCR or Emulsion PCR，ePCR)技术是将单分子或单细胞作为模板与PCR其它反应物(引物、DNA聚合酶、dNTPs等)同时包裹在油包水液滴中进行PCR扩增，通过对扩增产物进行荧光或化学标记的方法进行分析，在基因检测、表达、测序等领域已有广泛的应用。为实现单分子/细胞的高通量、高效检测并解决传统液滴PCR液滴大小不均匀、扩增效率低、有效单分子/细胞液滴产率低或需搭建复杂的在线分析系统等难题，我们把琼脂糖引入ePCR体系，提出了一种琼脂糖液滴PCR的微流控技术。我们采用一种特殊的超低凝胶点琼脂糖溶液与PCR各反应物混匀后作为水相，于室温下在简易的微流控芯片中被油相包裹成大小均匀的、连续的油包琼脂糖液滴并收集进行扩增。将扩增之后的油包琼脂糖液滴冷却成为包裹有扩增产物的琼脂糖微球。经过荧光染料染色，含有模板分子/细胞的微球会发出荧光，可以用显微拍照、FACS等分析手段进行后续处理。
　　 基于这种设计方案，本文第二章制作了流聚焦型玻璃微流控芯片，以低熔点琼脂糖溶液作为水相通入芯片，在油相的包夹下形成了大小均一可调的油包琼脂糖液滴。琼脂糖液滴经冷却、除油处理可以形成琼脂糖凝胶微球。我们对琼脂糖液滴及微球物理性质进行表征，结果显示琼脂糖液滴emulsion有良好的热稳定性，琼脂糖微球具有良好的机械性。
　　 第三章中，通过共价偶联的方式将PCR引物的一条偶联到琼脂糖大分子上，使其能够将扩增产物牵制在琼脂糖凝胶微球内部不扩散而同时不影响PCR正常扩增。我们研究了在不同浓度的琼脂糖溶液中进行PCR反应的扩增效率，选取1.5～2％的琼脂糖溶液作为液滴PCR的反应体系进行单分子液滴PCR，并对扩增后的微球进行荧光显微拍照和快速、准确的FACS分析。扩增产物的实时荧光定量PCR结果表明该方法的PCR效率可达90%以上。
　　 在本文第四章，将琼脂糖液滴PCR方法应用于致病菌的检测，突破了常规平板培养检测耗时、检测灵敏度低、检测量有限的缺陷，通过微流控技术与FACS相结合实现了对大肠杆菌单个活菌细胞的快速、高通量、高灵敏检测，体现出该方法在单细胞表达分析中的潜在应用价值。我们还发展了将引物连到聚丙烯酰胺高聚物上的高效合成方法，为高背景下两种菌的同时检测研究打下了基础。
　　 本研究开发了一种新的琼脂糖液滴PCR技术，在普通的微流控芯片上实现了单分子/细胞液滴PCR，并提高了有效液滴的产率和PCR扩增效率，在基因检测、新一代测序、肿瘤细胞早期诊断等领域具有广泛的应用前景和优势，并且在除了液滴PCR之外的其他现代生物分析领域(如单分子酶活性的研究、适配体筛选等、单细胞基因表达研究等)具有潜在的应用价值。