哮喘大鼠气道平滑肌细胞ERK1/2、TGF--β1的表达及吉贝咳喘胶囊干预的研究

摘要

目的:本课题是在细胞学水平上，运用基因检测技术观察细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1、ERK2)，磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(p-ERK1、p-ERK2)及转录生长因子1(TGF-β1)在哮喘大鼠气道平滑肌细胞中的表达以及使用苗药吉贝咳喘胶囊后的变化，探讨ERK信号转导通路对哮喘大鼠平滑肌细胞增殖的影响及吉贝咳喘胶囊的干预作用，以期从信号通路转导层面寻找有效抑制气道重塑的苗药组方，并为新药的研发打下基础。 方法:10只健康雄性SpragueDawly(SD)大鼠，随机平均分为空白组、模型组，参照吕国平等方法[1]造模，并加以改进。在实验第一天，10只SD大鼠腹腔注射抗原混悬液(内含生理盐水溶液0.01ML/g，1％卵蛋白(OVA)10mg，AL(OH)3100mg，灭活百日咳菌苗5×109个）1mL进行致敏;第15天后开始用1％OVA超声雾化吸入激发哮喘，共4周，末次激发后6小时内处死两组大鼠，在超净工作台内以无菌器械取肺组织行石蜡包埋切片，用Masson染色，观察气道形态学改变。分别用吉贝咳喘胶囊、地塞米松予两只日本长耳兔灌胃制作含药血清，用组织贴壁法进行大鼠气道平滑肌细胞体外培养，用免疫组化法进行细胞鉴定，运用western-bolt（蛋白免疫印迹）技术检测哮喘大鼠气道平滑肌细胞中ERK1、ERK2，p-ERK1、p-ERK2、TGF-β1的表达;应用RT-PCR（反转录聚合酶链反应）检测ERK1、ERK2、TGF-β1的mRNA表达。比较上述指标在两组大鼠气道平滑肌细胞中的表达。 结果: 1.在体实验:与空白组比较，模型组大鼠气道平滑肌厚度(WAm/Pbm)、支气管管壁胶原沉积厚度(Wcol/Pbm)均明显增加(P＜0.05)。 2.离体实验:与空白组比较，模型组、苗药组、地塞米松组支气管哮喘气道平滑肌细胞中ERK1、ERK2、TGF-β1的mRNA及ERK1、ERK2，p-ERK1、p-ERK2、TGF-β1的表达量均呈高表达(P＜0.05);与模型组比较，苗药组、地塞米松组以上指标的含量明显减少(P＜0.05)，但苗药组与地塞米松组比较未见明显差异性(P＞0.05)。 结论 1.模型组较空白组大鼠气道平滑肌厚度、支气管管壁胶原沉积厚度均明显增高，且有显著差异，表明哮喘大鼠支气管平滑肌增殖造模成功。 2.模型组支气管哮喘平滑肌细胞中ERK1、ERK2、TGF-β1的mRNA及ERK1、ERK2，p-ERK1、p-ERK2、TGF-β1表达量均明显高于正常组，且有显著性差异，说明ERK信号通路是引起气道平滑肌细胞增殖，进而形成气道重塑的重要途径。 3.苗药组、地塞米松组气道平滑肌细胞中ERK1、ERK2、TGF-β1的mRNA及ERK1、ERK2，p-ERK1、p-ERK2、TGF-β1表达量均明显低于模型组，且无显著性差异，表明吉贝咳喘胶囊及地塞米松均能够通过调控ERK信号转导通路，抑制哮喘大鼠气道平滑肌增殖，减轻气道重塑。

目录

声明

摘要

引言

1．实验材料与方法

1．1 在体实验

1．2．离体实验

1．3 分组提取细胞总蛋白

1．4 分组检测ERK1、ERK2、p-ERK1、p-ERK2、TGF-β1

1．5 分组提取气道平滑肌细胞总RNA

1．6 分组逆转录合成cDNA第一链

1．7 多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)

2 实验结果

2．1．实验动物一般情况

2．2 肺气道病理形态学特征

2．3．体外培养气道平滑肌细胞鉴定

2．4 各组气道平滑肌细胞ERK1、ERK2、p-ERK1、p-ERK2、TGF-β1的表达

2．5．各组气道平滑肌细胞ERK1、ERK2、TGF-β1 mRNA的表达

3．讨论

总结与展望

参考文献

一、缩略语表

二、文献综述 ERK信号转导通路及TGF-β1与支气管哮喘气道重塑

三、图片及表格

致谢

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