Tip60(Ser86)磷酸化单克隆抗体的制备与应用

摘要

Tip60（Tat Interactive Protein，60KDa）是目前研究最为透彻的MYST家族的组蛋白乙酰基转移酶(Histone Acetyltrsferease，HAT)，主要存在于由至少18亚基组成的核蛋白稳定复合物中。Tip60除了乙酰化组蛋白H2A、H3、H4之外，还能修饰一系列非组蛋白，例如髓细胞组织增生癌基因c(c-Myc)和激酶ATM等。然而在某些情况下，Tip60也会抑制转录活性。现已证明Tip60蛋白参与了基因表达调控、染色质重建、DNA损伤修复、细胞凋亡和肿瘤发生等过程。已有的研究证实了Ser86和Ser90是Tip60的两个磷酸化位点，其HAT活性也随之增强，因HAT活性是Tip60参与DNA损伤应答、β-淀粉样前体切割等过程所必需的，研究表明磷酸化的Tip60在这些过程中发挥重要作用。由于缺乏可用于研究磷酸化Tip60的抗体，研究者无法开展相关的实验。为了填补这个空白，我们成功地研发了抗Tip60pSer86的单克隆抗体。
　　 本文介绍我们如何采用杂交瘤技术制备Tip60Ser86磷酸化的单克隆抗体，并对该抗体做相关鉴定和检测。我们首先设计Ser86磷酸化多肽序列，将磷酸化多肽与血蓝蛋白KLH（keyhole limpet hemocyamin）偶联作为人工抗原免疫Bal b/C小鼠，通过ELISA法检测抗血清效价，从效价最好的小鼠身上获得脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，经多次有限稀释法筛选杂交瘤细胞，最终获得6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞：制备腹水，并以Protein G亲和层析柱分离纯化腹水，获得高纯度的单克隆抗体。通过已构建好的Tip60第86位丝氨酸突变体(S86A)，验证pSer86 MAb能特异性识别Ser86磷酸化的Tip60。高纯度、高效价、高特异性的pSer86 MAb将为深入研究Tip60 pSer86的细胞生物学功能提供实验基础。