解毒化瘀方逆转白血病细胞耐药株HL60/VCR耐药机制的研究

摘要

目的:本实验用解毒化瘀方（山慈菇、青黛、虎杖、蚤休、莪术、丹参、川芎、补骨脂）制备成含药兔血清后，对白血病细胞耐药株HL60/VCR进行处理。通过观察白血病细胞耐药株HL60/VCR中多药耐药基因P-gp及凋亡抑制基因Bcl-2的表达，探讨解毒化瘀方对白血病细胞耐药株HL60/VCR多药耐药现象的逆转机制。
　　方法:(1)细胞培养:分别将白血病细胞株HL60及白血病细胞耐药株HL60/VCR接种于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，在37℃、5％CO2条件下培养，取对数生长期细胞，2-3天传代一次，更换细胞液。
　　(2)用MTT法分别检测长春新碱VCR对自血病细胞株HL60和白血病细胞耐药株HL60/VCR这两种细胞的杀伤毒性，从而计算出白血病细胞耐药株HL60/VCR的耐药倍数。
　　(3)用免疫组化法对解毒化瘀方含药兔血清处理的白血病细胞耐药株HL60/VCR进行苏木伊红染色后，观察其显色，判断白血病细胞耐药株HL60/VCR中多药耐药基因P-gp的表达。
　　(4)用流式细胞术对解毒化瘀方含药兔血清处理的白血病细胞耐药株HL60/VCR进行荧光标记检测，观察结果判断白血病细胞耐药株HL60/VCR中凋亡抑制基因Bcl-2的表达。
　　结果:(1)白血病细胞耐药株HL60/VCR耐药倍数:在白血病细胞株HL60、白血病细胞耐药株HL60/VCR的培养液中分别加入2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L浓度梯度的长春新碱培养72小时后，自动酶标仪检测白血病细胞株HL60的IC50浓度OD值为33.127umol/L，而白血病细胞耐药株HL60/VCR的IC50浓度OD值为149.001umol/L，求得白血病细胞耐药株HL60/VCR的耐药倍数为4.5倍。
　　(2)用免疫组化法苏木伊红染色经解毒化瘀方含药兔血清处理的白血病细胞耐药株HL60/VCR进行检测，多药耐药基因P-gp在白血病细胞耐药株HL60/VCR中的表达:经免疫组化苏木伊红染色后的白血病细胞株HL60着色较浅。而未加药的白血病细胞耐药株HL60/VCR着色较深，呈玫瑰红色。干扰素处理的白血病细胞耐药株HL60/VCR着色变浅，干扰素加解毒化瘀方含药血清处理的白血病细胞耐药株HL60/VCR着色较干扰素处理的白血病细胞耐药株HL60/VCR着色更浅。低中高三个剂量组解毒化瘀方含药兔血清分别单独作用于白血病细胞耐药株HL60/VCR后，其着色均有不同程度的变浅，且剂量越大颜色越浅，低剂量着色相对最深，高剂量着色相对最浅，说明低剂量组的多药耐药基因P-gp的表达相对最高，高剂量相对最低。因此解毒化瘀方含药兔血清能降低白血病细胞耐药株HL60/VCR中的多药耐药基因P-gp的表达。
　　(3)用荧光标记的流式细胞术对解毒化瘀方含药兔血清处理的白血病细胞耐药株HL60/VCR进行检测，凋亡抑制基因Bcl-2在白血病细胞耐药株HL60/VCR中的表达:经荧光标记的流式细胞术处理后检测发现白血病细胞株HL60中的凋亡抑制基因Bcl-2呈低表达。而未加药的白血病细胞耐药株HL60/VCR中的凋亡抑制基因Bcl-2的表达明显偏高。干扰素处理的白血病细胞耐药株HL60/VCR中的凋亡抑制基因Bcl-2的表达降低，干扰素加解毒化瘀方含药血清处理的白血病细胞耐药株HL60/VCR中的凋亡抑制基因Bcl-2的表达较干扰素处理的白血病细胞耐药株HL60/VCR中的凋亡抑制基因Bcl-2的表达更低。低中高三个剂量组解毒化瘀方含药兔血清分别单独作用于白血病细胞耐药株HL60/VCR后，其凋亡抑制基因Bcl-2的表达均有不同程度的降低，且剂量越大降低的越多，低剂量组表达相对最高，高剂量组相对最低，因此解毒化瘀方含药兔血清能降低白血病细胞耐药株HL60/VCR中凋亡抑制基因Bcl-2的表达，且可能与剂量呈正相关。
　　结论:(1)解毒化瘀方含药兔血清能够降低多药耐药基因P-gp在白血病细胞耐药株HL60/VCR中的表达。
　　(2)解毒化瘀方含药兔血清能够降低凋亡抑制基因Bcl-2在白血病细胞耐药株HL60/VCR中的表达。
　　(3)解毒化瘀方含药兔血清具有一定的逆转白血病细胞耐药株HL60/VCR的多药耐药现象的作用。
　　(4)解毒化瘀方含药兔血清可以逆转白血病细胞耐药株HL60/VCR的机制可能与降低多药耐药基因P-gp和凋亡抑制基因Bcl-2的表达有关。