武夷山自然保护区大型真菌土壤粘细菌多样性及其次级代谢产物的研究

摘要

微生物是活性天然产物的重要来源。本论文研究以武夷山自然保护区大型真菌和土壤粘细菌为对象,分两篇分别探讨武夷山自然保护区大型真菌的生物多样性和分离1株大型真菌发酵产物的13个新二萜化学成分;通过LC-HRMS分析、化合物数据库检索、基因组分析和PCR筛选等多种手段,探索粘球菌的化学分类及其新次级代谢产物的定向分离,发掘产生埃博霉素的新粘细菌资源和LC-HRMS追踪分离新PKS&NRPS生物合成基因簇的产物,为深入开发武夷山自然保护区大型真菌和土壤粘细菌的新活性天然产物提供了丰富的菌种资源和可行的研究模式。
　　 第一篇为武夷山自然保护区大型真菌的生物多样性以及可培养大型真菌辐毛鬼伞Coprinus radians M65菌株发酵产物的化学成分研究。武夷山自然保护区地处亚热带,是中国东南亚大陆生物多样性最丰富的地区,具有全球生物多样性保护意义。本研究从2006年7月-2008年7月先后五次对武夷山保护区部分区域的大型真菌进行采集,共获得300多份子实体,形态鉴定子实体标本178份,包括3个目19个科108个种的大型真菌。利用rDNA的ITS片段对79个子实体和75个来自NCBI的参考序列进行系统发育和多样性分析,结果表明17个进化支共包含14个分类群,其中Russulaceae和Boletales是发育树中最大的进化支;另外三个比较大的分支Russulaceae、Boletale和Amanitaceae独立进行系统发育分析,结果表明武夷山保护区蕴含着十分丰富的高等真菌资源。此外,本论文研究对分离自大型真菌的辐毛鬼伞Coprinus radians M65菌株的发酵产物,开展了系统的分离纯化和结构测定,发现13个新二萜化合物Radianspenes A-M。其中Radianspene C显示良好的细胞毒活性,Radianspene M为首个ent-kaurane型二萜之外的新颖二萜二聚体。
　　 第二篇为粘细菌次级代谢产物的研究和PKS&NRPS基因簇c941的产物的初探。从全国各地采集土样和腐烂植物分离得到的239株粘细菌菌株进行纯化,得到约157株纯培养粘细菌,通过形态鉴定和16S rDNA测序比对相结合,最终鉴定粘球菌61株,珊瑚菌6株,堆囊菌90株。
　　 关于粘细菌的新活性天然产物的系统发掘,首先采用HPLC-HRMS筛选的方法,联合德国萨尔大学的粘细菌已知化合物数据库,对61株粘球菌(Myxococcus)的代谢产物进行系统分析,发现myxovirescin、cittilin和myxochromid可能有种级化学分类学意义,DKXanthen和myxalamid可能有属级化学分类学意义;发现叶柄粘球菌M.stipitatus SBMx132菌株能产生少量的DKxanthen和myxalamid等已知化合物外,还产生一类极性比较小的未知化合物MxUA。通过LC-HRMS示踪对其进行分离纯化,共分离得到7个单体化合物,其中化合物522、524和538通过波谱解析、酯交换反应和GC-MS/MS检测,最终确定为新聚酰胺类化合物。其次,重点对85株堆囊菌的粗提物进行活性筛选,并结合LC-HRMS分析和数据库检索,最后得到7株可能产生新结构活性化合物的候选菌株;使用PCR筛选,结合代谢产物的LC-MS分析,从60株纤维堆囊菌中发现1株埃博霉素相对高产的菌株XMU-So-112。最后,本论文研究通过对黄色粘球菌Myxococcus xanthus A47菌株基因组的生物信息学分析,以一个新PKS&NRPS生物合成基因簇c94-1为研究对象,通过单交换同源重组,得到突变株47-c94_orf3-和47-c94_orf2-和加强表达突变株A47-tn5;比较3株突变株以及野生型菌株的次级代谢产物,发现化合物777(双电荷离子m/z777.92)可能为基因簇c94_1的生物合成产物,这个结论得到该化合物的二级质谱的分析结果的验证和支持。