嵌合型乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒的原核表达及初步应用

摘要

乙肝病毒(Hepatitis virus B,HBV),具有高效人肝细胞靶向性,为乙肝病毒样颗粒成为基因载体提供了一定的靶向基础。作为乙肝病毒结构蛋白之一的核心蛋白(HBcAg)可以自组装形成正二十面体并具有良好的解聚/自组装功能,其C末端的富集正电荷序列可以通过静电吸引力与核酸相互作用,为基因载体提供了新的选择。
　　 本文利用基因工程方法构建,并通过原核表达系统诱导表达几种不同的以HBcAg为基础的病毒样颗粒(HBc VLPs),对其理化性质及基因载体应用进行初步研究。主要研究如下:
　　 (1)由NCBI数据库得到HBc-144、HBc-183和HBc-183-preS1核酸编码序列并结合大肠杆菌偏好密码子偏好性进行密码子优化后,全基因合成获得HBc-144、HBc-183和HBc-183-preS1目的片段。利用PCR技术以HBc-144为模板构建了HBc-144-His和HBc-144-Tat片段。并通过定点突变的方法使HBc-183和HBc-preS1的第129-130个氨基酸之间插入带有自由氨基的赖氨酸。
　　 (2)将获得的目的片段连接至原核表达载体pET43.1a上,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主进行诱导表达。通过硫酸铵沉淀、DEAE离子交换色谱和Sepharose CL4B琼脂糖凝胶分子筛对7种病毒样颗粒进行纯化,得到了90％以上纯度的病毒样颗粒。
　　 (3)利用透射电镜(TEM)、Western blot等方法对病毒样颗粒理化性质进行鉴定得到了有明显病毒颗粒状的7种蛋白。另外,考察了HBc-144、HBc-144-Tat、HBc-183三种病毒样颗粒在尿素作用下的解聚与自组装效果。利用荧光光谱仪测定了HBc-144、HBc-144-Tat和HBc-183对荧光素酶质粒pGL3的包封能力。最终得出HBc-183对基因的包裹能力最强,包封率可达到90.78±1.79％。
　　 (4)VLPs的基因运输能力通过流式细胞仪和化学发光仪测定。7种HBcVLPs均具有高效的细胞内吞作用,在1 h内即可达到99％以上细胞内吞率。通过研究HBc VLPs介导pNA31-EGFP和pGL3在人肝癌细胞HepG2中的报告蛋白表达来考察HBc VLPs作为基因载体的能力。