基于有害藻华调控的海洋微生物及其活性物质抑藻作用的机理研究

摘要

赤潮不仅破坏海洋生态系统，威胁海洋生物的生存和人类的健康，也给社会的发展带来巨大的经济损失!近年来，我国赤潮发生次数一直高居不下，区域影响面积不断扩大，其造成的危害及损失持续加剧。基于“微生物在有害藻华生消过程中可能扮演重要角色”这一观点认识，应用海洋微生物来防治赤潮已成为当前的研究热点。通过多年来本领域专家学者的研究表明，抑藻微生物的应用为赤潮的防治工作提供了潜在的有效途径。
　　 本论文以典型有毒赤潮藻——球形棕囊藻和塔玛亚历山大藻为主要研究对象，通过扩大筛选所用的目标藻种的规模和数量，根据不同藻种的培养特征，选择液体三角瓶法和固体平板法两种筛选方式，进行了抑藻菌的批量筛选，并对具有高效性稳定性的菌株开展多相分类系统鉴定工作。通过进行高溶解性、低细胞毒性有机溶剂的筛选实验，确定了抑藻活性试验适宜的助溶剂，并在考察抑藻菌株发酵条件基础上，开展了后续抑藻活性物质的分离纯化鉴定及抑藻机理的初步探讨研究。本论文的主要研究结果如下:
　　 1、通过初步考察菌落形态（隆起、褶皱、平坦）、大小、颜色、有无同心环及表面是否光滑湿润，放线菌和真菌的孢子颜色、菌丝颜色、能否产生可溶性色素及其颜色等指标，利用3类不同的分离培养基（细菌分离培养基、放线菌分离培养基、真菌分离培养基）共分离到菌株521株。
　　 2、利用固体平板筛选法，针对可以在平板上生长的实验藻种，进行抑藻菌株批量筛选，自521株分离到的菌株中，筛选到1株叉鞭金藻抑制菌，3株青绿藻抑制菌，2株赤潮异弯藻抑制菌，2株日本星杆藻抑制菌;利用液体三角瓶筛选法，针对球形棕囊藻，进行抑藻菌株的筛选，自521株分离到的菌株中，筛选到27株球形棕囊藻抑制菌，其中13株为高效抑制菌株（抑藻率＞75％）;对13株高效抑制球形棕囊藻生长的菌株进行多相分类鉴定，该13株高效抑藻菌被鉴定归属于链霉菌属。
　　 3、通过对9种有机溶剂对球形棕囊藻和塔玛亚历山大藻抑制率的回归分析，确定了丙酮和DMSO对两种藻均具有较低的毒性作用，考虑到丙酮易挥发，长期接触对人身体健康的可能影响，选择DMSO作为脂溶性抑藻活性物质的优选助溶剂。
　　 4、通过分别对高效抑藻菌株O3-26和O4-6产活性物质适宜发酵条件的考察，确定了O3-26以甘露醇为唯一碳源、硝酸钠或硝酸钾为唯一氮源、培养基pH7.5、37℃、150rpm培养条件，发酵6d;O4-6以淀粉为唯一碳源，硝酸钠或硝酸钾为唯一氮源、培养基pH7.5、37℃、150rpm培养条件，发酵6d;用于第四章抑藻活性物质的分离纯化与鉴定研究。
　　 5、研究发现，抑藻菌株O4-6代谢产生的活性物质热稳定性较好，能够耐受强酸强碱的胁迫，分子量大于500Da，脂溶性较强;通过对O4-6抑藻活性物质的提取纯化获得高纯度的抑藻化合物，确定该化合物的分子式为C40H68O11，并鉴定为尼日利亚菌素。
　　 6、随尼日利亚菌素作用时间的延长，球形棕囊藻细胞内部SOD酶活增强，细胞内部处于过度氧化状态，该状态使藻细胞内部的相关膜结构受到损伤，膜脂的过氧化加剧促使MDA在细胞内积累，核酸结构亦开始受到破坏，维持细胞膜稳定结构的物质被氧化破坏导致膜透性增大，胞内物质大量外渗，整个藻细胞结构逐步解体;尼日利亚菌素作用下，其诱导球形棕囊藻表达产生一系列差异蛋白，这些差异蛋白可能用于抵抗尼日利亚菌素的胁迫。
　　 7、研究还发现，抑藻菌株SP48培养24h后发酵液中铵离子的浓度高达1.4mgN/L，该浓度远高于抑藻率为70％的铵离子浓度(0.4mgN/L);铵离子对塔玛亚历山大藻生长的影响，在抑藻菌分离筛选过程中不容忽视。铵离子的存在掩盖了抑藻菌产生的其他活性物质对塔玛亚历山大藻生长的抑制作用，使我们不能确定抑藻菌株是否能够代谢产生除铵离子以外的抑藻活性物质。

目录

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摘要

英文摘要

第一章 前言

1 赤潮的危害及成因

1．1 赤潮的危害

1．2 赤潮的成因

2 赤潮的防治方法

2．1 赤潮的预防

2．2 赤潮的治理

3．抑藻菌及其抑藻活性物质研究进展

3．1 抑藻菌研究

3．2 抑藻活性物质研究

3．3 抑藻活性物质作用机理研究

4．海洋放线菌研究进展

4．1 海洋放线菌来源的抗生素

4．2 海洋放线菌来源的其他活性物质

5 本论文的研究目标、内容及意义

5．1 研究目标

5．2 研究内容

5．3 研究意义

第二章 抑藻菌的分离筛选及鉴定

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 菌株分离及抑藻菌株筛选

2．2 抑藻菌株菌落及菌体形态特征

2．3 抑藻菌株生化及培养特征

2．4 抑藻菌株分子鉴定及系统发育分析

3 讨论

4 本章小结

第三章 有机溶剂藻细胞毒性研究及高效抑藻菌株发酵条件考察

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 实验结果

2．1 球形棕囊藻激发光及吸收光波谱扫描

2．2 活体荧光染料FDA染色条件优化

2．3 有机溶剂对塔玛亚历山大藻抑制率的回归分析

2．4 有机溶剂对球形棕囊藻抑制率的回归分析

2．5 碳源及氮源对高效抑藻菌株抑藻率的影响

2．6 培养条件对高效抑藻菌株抑藻率的影响

3 讨论

4 本章小结

第四章 抑藻活性物质的分离纯化鉴定及抑藻特性研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 实验结果

2．1 菌株Pseudoalteromonas sp．SP48抑藻特性探究

2．2 菌株Streptomyces sp．O4-6抑藻活性物质理化特性研究

2．3 菌株Streptomyces sp．O4-6抑藻活性物质提纯鉴定

3 讨论

4 本章小结

第五章 尼日利亚菌素抑藻(球形棕囊藻)机理探讨

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 尼日利亚菌素对球形棕囊藻生长的影响

2．2 球形棕囊藻内部结构形态

2．3 球形棕囊藻细胞抗氧化系统检测

2．4 最大光化学效率及表观光合电子传递效率检测

2．5 球形棕囊藻细胞核酸及蛋白的提取与分析

2．6 球形棕囊藻细胞内部Na+、K+离子浓度的测定

3 讨论

4 本章小结

第六章 结论与展望

1 结论

2 创新点

3 展望

参考文献

附录

Ⅰ 缩略语对照表

Ⅱ常用培养基

Ⅲ 载体图谱

Ⅳ DNA分子量标准

Ⅴ 菌株O4-6来源的抑藻活性物质结构鉴定NMR图谱

Ⅵ 研究生期间参与课题、发表学术论文、申请专利及获得奖励情况

致谢