Irx5a基因在斑马鱼早期胚胎发育表达谱及与Hoxb4基因相关性研究

摘要

Irx5基因(Iroquois5)于1993年在小鼠体内首先发现，后在人体内也发现高度同源的Irx5基因。对其的研究发现，Irx5基因有调控细胞分化及促进细胞增殖两方面作用。Irx5基因在小鼠心室肌、肺泡及视网膜双极神经细胞的形成中其重要作用;同时Irx5基因可通过调控下游的p53、p21来促进人类前列腺癌细胞、爪蟾神经细胞增殖。
　　同源盒基因(homeobox gene，HOX)编码一类转录因子，不仅在胚胎发育中起作用，对造血干细胞(HSC)的自我更新和增殖分化也起重要作用。HOX家族中的Hoxb4是造血细胞分化早期的重要调控因子，对调节HSC自我更新与分化间的平衡起到重要作用。Hoxb4基因编码一类具有同源盒DNA依赖的结构域核蛋白，是一种特异性的转录因子，它能被动透过细胞膜进入细胞内，与细胞因子共同作用下对HSC的扩增起促进作用。
　　目的:构建Irx5a基因部分序列的体外转录载体Irx5a-pCS2+，通过体外转录制备其反义mRNA探针;研究Irx5a基因在斑马鱼早期胚胎发育的表达情况，并比较与在原始造血组织中过表达Hoxb4基因的转基因系斑马鱼中Irx5a基因表达的差异，从而为研究Irx5a基因相关功能以及其与Hoxb4相关性研究奠定基础。
　　方法:分别收集0.75hpf-72hpf之间多个时相的Tubingen野生型斑马鱼胚胎，从斑马鱼胚胎提取总RNA，应用RT-PCR方法扩增Irx5a基因的部分序列，将其克隆入pCS2+质粒中，经菌落PCR、酶切法及DNA测序鉴定正确后，利用体外转录体系制备Irx5a的反义mRNA探针，选取0.75hpf-72hpf之间多个时相的Tubingen野生型斑马鱼胚胎作为空白对照组，18 hpf-72hpf之间多个时相的Tg:(Lmo2: Cre; Lmo2: LDEL-EGFP转基因斑马鱼胚胎作为实验对照组，18hpf-72hpf之间多个时相的Tg:(Lmo2: Cre; Lmo2:LDEL-Hoxb4-EGFP)转基因斑马鱼胚胎作为实验组。以Irx5a基因反义mRNA探针经斑马鱼全胚胎原位杂交通过观察染色情况研究斑马鱼胚胎发育过程中Irx5a基因的表达情况及在斑马鱼体内原始造血组织中过表达HoxB4基因情况下Irx5a基因的表达情况有无改变。
　　结果:Irx5a-pCS2+重组质粒经菌落PCR、酶切和测序鉴定正确，电泳结果显示以Irx5a的体外转录载体为模板通过体外转录可得到Irx5a的反义mRNA探针，并通过原位杂交对探针的可用性进行了确认。观察到3.7hpf空白组斑马鱼胚胎细胞、9hpf、12hpf空白组斑马鱼胚胎后脑神经板及腹部中胚层可见黑色的阳性杂交信号，18hpf空白组斑马鱼胚胎中脑、间脑、后脑、侧板中胚层、咽弓及尾部原肾管可见黑色的阳性杂交信号，24hpf、30hpf、36hpf、48hpf空白组斑马鱼胚胎中脑、间脑、后脑、咽弓、脊索、耳泡囊及脊髓可见黑色的阳性杂交信号，72hpf空白组斑马鱼胚胎中脑、间脑、后脑、耳泡囊及视网膜神经节细胞层可见黑色的阳性杂交信号。胚胎发育时期18hpf空白对照组，实验对照组，实验组斑马鱼Irx5a基因表达情况存在明显差异，24hpf、30hpf、36hpf、48hpf、72hpf空白对照组，实验对照组，实验组斑马鱼Irx5a基因表达情况基本一致。
　　结论:成功构建Irx5a-pCS2+体外转录载体，并成功制备Irx5a反义mRNA探针，了解了Irx5a基因在野生型斑马鱼胚胎发育时期内的表达情况，初步证明了Irx5a基因作为Hoxb4基因下游靶基因的可能性。

目录

摘要

1．前言

2．材料和方法

2．1 主要材料

2．2 主要仪器及器械

2．5 引物及其序列引物及其序列(同时引入BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位点及保护碱基)

2．6 实验方法

2．7 实验地点

3 结果

3．1 Tubingen鱼系野生型胚胎总RNA提取

3．2 Irx5a基因RT-PCR结果

3．3 Irx5a-pCS2+重组质粒的鉴定

3．4 线性化Irx5a-pCS2+重组质粒

3．5 Irx5a反义mRNA探针电泳

3．6 斑马鱼全胚胎原位杂交

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

缩略语表

声明

Irx5基因及Hoxb4基因的功能特点及二者的相关性研究