利用质谱技术筛选RIP3激酶下游底物

摘要

RIP3作为受体相互作用蛋白家族（Receptor interacting-protein RIPs）重要的一员，是具有特异的丝氨酸(Serine)/苏氨酸（Threonine）激酶活性的蛋白。研究表明，RIP3是TNF诱导的细胞凋亡与细胞坏死相互转换的分子开关，RIP3是TNF诱导多种细胞（如L929细胞、N细胞、MEF细胞）的坏死所必需的。因此，RIP3在诱导细胞死亡方面有着重要的作用。虽然RIP3在调控细胞坏死发挥着重要作用，但其作为一个磷酸激酶，对其下游调控的底物却知之甚少。哪些蛋白会被RIP3及其下游激酶磷酸化，在介导细胞死亡过程中RIP3与哪些蛋白相互作用，RIP3介导细胞死亡的分子机制等科学问题亟待解决。
　　 因此本论文试图使用定量磷酸化组的方法去寻找RIP3激酶的底物，在研究中，本论文以来源于RIP3野生型小鼠和RIP3敲除小鼠的原代腹腔巨噬细胞和永生化的小鼠胚胎纤维原细胞为研究对象，分别用TNF和LPS刺激细胞，然后比较RIP3野生型成纤维细胞和RIP3敲除型成纤维细胞及野生型巨噬细胞和RIP3敲除型巨噬细胞的磷酸化蛋白组的差异。文章利用一系列技术，如SILAC（稳定同位素标记的氨基酸细胞培养）及其spike-in SILAC技术、FASP（超滤管辅助样品制备）、IMAC（金属离子偶联亲和层析）、HILIC（亲水相互作用亲和层析）以及纳升液相串联质谱，深入地分析了RIP3野生型细胞和RIP3敲除型细胞之间磷酸化蛋白组的不同，而且本论文证实这种方法确实可行，所得数据也具有可信性。本研究鉴定到巨噬细胞中4306个蛋白的14057个磷酸化肽段和MEF细胞中1785个蛋白的4732个磷酸化肽段，其中在巨噬细胞和MEF细胞中总共筛选到14081个磷酸化位点。这些磷酸化位点中有6131个已知的磷酸化位点，而其中另外7950个磷酸化位点到目前为止还未被发现。同时研究中又利用生物信息学分析揭示了RIP3激酶及其下游激酶可能的底物识别基序，其中pSXP motif很可能是RIP3特异识别的基序。本论文的研究工作筛选到了一系列RIP3激酶的潜在底物，为后续的深入研究打下了基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 细胞凋亡和细胞坏死

1．1．1 细胞凋亡和细胞坏死的定义

1．1．2 细胞凋亡和细胞坏死的机制

1．1．3 细胞凋亡和死亡的相关研究

1．2 肿瘤坏死因子(TNF)诱导的细胞凋亡和细胞坏死

1．2．1 TNF简介

1．2．2 TNF诱导的细胞凋亡和细胞坏死

1．2．3 TNF诱导的细胞凋亡和细胞坏死及之间的转换及其分子开关

1．3 受体相互作用蛋白3(RIP3)

1．3．1 RIP家族简介

1．3．2 RIP家族的结构特点

1．3．3 RIP3能诱导某些细胞凋亡

1．3．4 RIP3抑制NF-κB的激活

1．3．5 过量表达砒P3诱导NF-κB的激活

1．3．6 RIP3是细胞凋亡与细胞坏死相互转换的分子开关

1．3．7 RIP3调节细胞坏死的最新研究进展

1．4 磷酸化蛋白质组学

1．4．1 磷酸化蛋白质组学的定义

1．4．2 磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法

1．4．3 SILAC和spike-in SILAC

1．5 立题背景

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 哺乳动物细胞

2．1．2 实验相关药品和试剂

2．1．3 实验室主要仪器

2．2 分子相关实验方法

2．2．1．质粒载体介绍

2．2．2 表达质粒的构建

2．2．3 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2．2．4 质粒DNA的提取

2．3 细胞相关实验和方法

2．3．1 细胞培养

2．3．2 细胞的同位素标记

2．3．3 细胞转染

2．4 质谱相关实验和方法

2．4．1 肽段的酶解及脱盐方法

2．4．2 磷酸化肽段的富集和分离

2．5 蛋白质相关实验和方法

2．5．1 免疫沉淀激酶分析

2．5．2 免疫共沉淀

2．5．3 免疫印迹及酸化蛋白检测

2．5．4 相关溶液配制

第三章 结果与分析

3．1 细胞的选择、处理及其设计思路

3．1．1 以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象

3．1．2 以小鼠胚胎纤维原细胞(MEF)为研究对象

3．1．3 细胞内RIP3的激活及其激酶活性分析

3．2 以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象实验的结果分析

3．2．1 混合磷酸化肽段的H／L ratio

3．2．2 RIP3-／-及RIP3+／+巨噬细胞中的特异性肽段

3．2．3 RIP3-／-巨噬细胞与RAW264.7细胞中及PIP3+／+巨噬细胞与RAW264.7细胞中具有明显差异的肽段

3．2．4 RIP3+／-巨噬细胞与RIP3-／-巨噬细胞中具有明显差异的肽段

3．3 以小鼠胚胎纤维原细胞(MEF)为研究对象实验的结果分析

3．3．1 RIP3+／+巨噬细胞与RIP3-／-巨噬细胞中具有明显差异的肽段

3．3．2 SILAC标记实验与spike-in SILAC标记实验的比较

3．4 Motif-X分析预测RIP3磷酸化下游底物的磷酸化位点

3．5 五个候选下游底物与RIP3的相互作用

3．5．1 Myc-RIP3或Flag-RIP3能与AKTIP、ZBP1、IRS2和TSC2相互作用

3．5．2 RIP3可使共表达的IRS2发生磷酸化修饰

3．6 结果分析与讨论

附录1 图表索引

附录2 缩略语及中英文对照

参考文献

致谢