流式微球分析技术检测人心肌钙蛋白T方法的建立

摘要

目的:建立流式微球分析(cytometric bead assay，CBA)技术检测人心肌钙蛋白T(cTnT)方法。
　　方法:用鼠抗人的cTnT的单克隆抗体包被在已激活的羧基化聚苯乙烯微球上，用封闭液封闭微球上未结合单抗的位点，然后再用包被好的微球与检测标本进行抗原抗体免疫反应，并加入羊抗人cTnT的多克隆抗体和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的驴抗羊的多克隆抗体，室温避光免疫反应一定时间，洗涤后，上流式细胞仪检测FITC的荧光强度，以此测定标本中cTnT含量。通过加入不同含量的鼠抗人cTnT单克隆抗体与已激活的微球进行偶联，再与过量FITC标记羊抗鼠IgG反应，根据检测到的荧光强度，选择适当的鼠抗人cTnT单克隆抗体加入量;加入标本和抗体后，通过免疫反应不同的时间，选择最适免疫反应时间;加入标本和抗体免疫反应后，通过洗涤不同的次数，选择适当的洗涤次数;通过加入不同浓度的羊抗人cTnT多克隆抗体与一定量的cTnT标准品、一定量的偶联微球和过量的FITC标记驴抗羊IgG免疫反应，根据检测到的荧光强度，选择适当的羊抗人cTnT多克隆抗体工作浓度;通过加入不同浓度的FITC标记驴抗羊IgG与一定量羊抗人cTnT多克隆抗体、一定量的cTnT标准品、一定量的偶联微球免疫反应，根据检测到的荧光强度，选择适当的FITC标记驴抗羊IgG为最佳工作浓度。在各种抗体加入量和免疫反应最佳条件下，对本法进行方法学评价。
　　结果:通过实验摸索，选择每1.25×106个微球加入10μg的鼠抗人cTnT单克隆抗体为最佳加入量;加入标本和抗体后，选择避光免疫反应120min，洗涤一次，上流式细胞仪检测;选择8μg/ml羊抗人cTnT多克隆抗体为最佳工作浓度;选择20μg/ml FITC标记驴抗羊IgG为最佳工作浓度。在各种抗体加入量和免疫反应最佳条件下，本方法的检测灵敏度为16.0pg/mL，线性范围是80-5000 pg/mL，批内重复性变异系数为5.2-11.3％，回收率是94.7-11.5％，高浓度的甘油三脂、胆固醇和胆红素的干扰率分别为7.0％-13.5％、9.4％-17.5％和5.4％-16.8％，与Roche Elecsys的电化学发光法无显著差异。
　　结论:血浆cTnT可以用CBA技术进行检测，为cTnT的检测提供了另一种选择，有助于cTnT检测试剂盒的进一步研制，也为荧光编码微球进行多指标的检测方法研究提供了方向，打下了基础。

目录

摘要

1．前言

2．材料和方法

2．1 材料

2．2 实验条件优化

2．3 方法学评价

3．结果

3．1 微球浓度

3．2 鼠抗人cTnT单克隆抗体量的选择结果

3．3 免疫反应时间选择

3．3 洗涤次数选择

3．5 证明是否存在非特异性结合实验

3．6 羊抗人cTnT多克隆抗体浓度选择结果

3．7 FITC标记驴抗羊IgG浓度选择结果

3．8 线性范围

3．9 灵敏度试验

3．10 方法重复性实验

3．11 回收实验

3．12 干扰试验

3．13 方法对比

4．讨论

4．1 心肌钙蛋白T诊断意义

4．2 目前检测人心肌钙蛋白T的方法优缺点

4．3 流式微球分析法特点

5．结论

参考文献

致谢

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