FTY720联合共刺激分子单克隆抗体诱导延长同种异基因抗原致敏小鼠心脏移植的存活及机制研究

摘要

背景和目的:临床上器官功能衰竭终末期需要进行器官移植的患者，实际上大部分由于受到多次感染、妊娠、多次输血、透析或者已行组织/器官移植，使得体内存在不同水平的抗原特异性或者非特异性记忆性T细胞(Tm)，对二次移植可产生超急性排斥反应。皮肤预致敏小鼠可以模拟人体内的这种Tm存在的状态，尝试在皮肤预致敏小鼠的二次心脏移植模型中，使用FTY720和共刺激分子单克隆抗体的抑制方案，尽量减少Tm对二次移植物的浸润，从而达到延长移植物生存期的目的，并探讨此中可能的机制。
　　 方法:首先构建从BALB/C小鼠到C57BL/6小鼠的初次背部皮肤移植，4周后，受体C57BL/6小鼠排斥掉移植的皮肤，以此皮肤预致敏小鼠为受体，BALB/C小鼠为供体，进行颈部异位心脏移植术，即是二次移植。根据用药治疗情况分成四组，对照组、FTY720组、共刺激分子单克隆抗体组和联合用药组。给药方案为:FTY720的剂量为2mg·kg-1·day-1，心脏移植术前3天给药，直至术后第14天;共刺激分子单克隆抗体(Costimulator molecule monoclonal antibody,anti-mouse-LFA-1 and anti-mouse-CD40L mAb)用量分别为0.1 mg/次anti-mouse-LFA-1 mAb和0.25mg/次anti-mouse-CD40L mAb，术后第0，2，4，6天各给药一次。观察心脏移植物生存期，运用免疫细胞学、分子学和蛋白学检测TEM、Treg细胞，IL-2、IFN-γ和IL-10、TGF-β等细胞因子，以及移植物中细胞因子mRNA表达的情况和移植物病理切片等研究其可能机制。
　　 结果:
　　 1、FTY720组和共刺激分子单克隆抗体治疗组的平均生存期(MST)分别为4.6天和4.7天，比较对照组MST为3.4天，具有差异性;在联合用药组，MST达到了18天，比较对照组和共刺激分子单克隆抗体组差异性显著。
　　 2、在受体鼠外周血，治疗组的CD4+和CD8+T细胞均明显降低;同时FTY720能使外周血中的CD4+和CD8+效应性Tm(TEM)(CD44high CD62Llow)比例下降，联合组比较共刺激分子单抗组，TEM比例下降也均具有显著统计学差异。FTY720使得脾脏中的CD4+TEM、CD8+TEM比例比较对照组没有统计学差异;联合组CD4+TEM的变化较为显著; FTY720组和联合组的CD4+FOXP3+Treg比例比较对照组有明显的升高，联合组比较单克隆抗体组升高亦具有统计学差异。外周淋巴结的TEM变化与在脾脏中相似;比较对照组，Treg在联合组的比例有明显升高。
　　 3、MLR结果显示，FTY720可以明显抑制T淋巴细胞增殖，联合组更明显，CFSE荧光染色测定T细胞增殖实验的结果与此类似;MLR上清的细胞因子含量测定显示FTY720组IL-2，INF-γ水平有不同程度下降，联合组更明显; TGF-β在联合用药组变化趋势与IL-2相反。
　　 4、FTY720可以明显减少CD8+TEM对心脏移植物的浸润;心脏移植物病理ISHLT评分也显示了FTY720和联合用药组比较对照组存在明显差异;联合用药组比较单用抗体组，ISHLT评分差异也具有显著性;治疗组心脏移植物的IL-2、IFN-γ mRNA的表达有不同程度下降，此差异在联合组最为明显;而IL-10、FOXP3的趋势则与IL-2等相反。
　　 5、通过体重记录和相关器官组织的病理切片评分，评估FTY720和抗体对受体小鼠的短期不良反应，发现两者的安全性较好，病理评分不认为有肝肾肺和胃肠道的急性损害作用。
　　 结论:
　　 ①FTY720促进归巢，致使外周血CD4+和CD8+T细胞减少，并且大幅度减少CD4+和CD8+TEM亚群的比值，减少TEM对移植物的浸润;
　　 ②FTY720单独运用或者联合共刺激分子单克隆抗体可以诱导Treg的增殖、分化，增加IL-10和TGF-β的mRNA表达，促进其分泌的相应细胞因子水甲升高;
　　 ③FTY720可以明显抑制TEM的增殖，抑制TEM分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，联合共刺激分子单克隆抗体可以协同加强此抑制功能;
　　 ④FTY720和共刺激分子单克隆抗体的短期不良反应较小。

目录

声明

摘要

第一章、前言

1 器官移植概述

2 T细胞及其与器官移植研究进展

2．1 Th1／Th2与器官移植

2．2 Treg与器官移植

2．3 Tc与器官移植

3 记忆性T细胞与器官移植研究进展

3．1 Tm细胞的免疫学特性

3．2 Tm的分型与功能

3．3 Tm与器官移植研究进展

3．4 免疫抑制方案作用于Tm诱导耐受的研究进展

4 FTY720研究进展

5 共刺激分子单克隆抗体研究进展

6 小鼠颈部异位心脏移植的意义

7 研究目的、创新、意义及内容

第二章、实验材料和方法

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验仪器和耗材

1．3 实验药物试剂

2 实验方法

2．1 免疫动物模型的构建

2．2 组织学试验方法

2．3 细胞学检查实验方法

2．4 基因蛋白相关实验及方法

2．5 统计学分析

第三章、实验结果及分析

1 FTY720和共刺激分子单克隆抗体延长初次小鼠心脏移植物生存期及机制初探

1．1 FTY720和共刺激分子单克隆抗体对初次心脏移植物生存期的延长

1．2 FTY720和共刺激分子单克隆抗体抑制T淋巴细胞的增殖

1．3 FTY720和共刺激分子单克隆抗体减少初次移植心脏的淋巴细胞浸润

2 FTY720联合共刺激分子单克隆抗体延长同种异基因预致敏小鼠心脏移植的生存期及机制研究

2．1 FTY720和共刺激分子单克隆抗体延长同种异基因预致敏小鼠心脏移植生存期

2．2 FTY720和共刺激分子单克隆抗体减少预致敏小鼠外周血T细胞和TEM

2．3 FTY720和共刺激分子单克隆抗体使外周血中细胞因子水平发生变化

2．4 FTY720和共刺激分子单克隆抗体对脾脏TEM、Treg的影响

2．5 FTY720和共刺激分子单克隆抗体对外周淋巴结中T淋巴细胞、TEM和Treg的影响

2．6 FTY720和共刺激分子单克隆抗体对T细胞和TEM功能的影响

2．7 FTY720和共刺激分子阻滞剂对二次心脏移植物影响

2．9 FTY720以及共刺激分子阻滞剂的毒副作用浅析

第四章、讨论

第五章、结论和展望

参考文献

附录

附录一 文中部分缩略语及中英文对照

致谢

附录三 研究生阶段参与发表文章