深海超嗜热古菌Palaecoccus pacificus DY20341T耐热机制的初步研究

摘要

深海热液区于1977年被发现以来，是当今微生物学研究的热门区域。通过对分离自东太平洋洋中脊热液区的超嗜热古菌Palaecoccus pacificus DY20341T的耐热蛋白和不同温度培养条件下的蛋白质组的分析，推测其对高温环境的适应机制，并完善了对菌株DY20341T的基因组注释。
　　 本文将菌株总蛋白100℃热处理1hr后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法，分离得到6个耐热蛋白。通过MALDI-TOF-TOF比对菌株DY20341T全基因组数据库，鉴定结果如下:耐热蛋白1(无机焦磷酸酶/Inorganicpyrophosphatase，20kDa)，耐热蛋白2（ABC转运体寡肽结合蛋白/Oligopeptidebinding ABC transporter，90kDa），耐热蛋白3(ABC转运体二肽结合蛋白/Dipeptide-binding ABC transporter，80kDa)，耐热蛋白4(α-糖苷周质结合蛋白前体/Alpha-glucosides-binding periplasmic protein AglE precursor，46kDa)，耐热蛋白5(TRAP转运体溶质受体/TRAP transporter solute receptor，35 kDa)和耐热蛋白6(5'-脱氧甲硫腺苷磷酸化酶/5'-methylthioadenosine phosphorylase，29 kDa)。耐热蛋白1(PAP0157)参与氧化磷酸化途径产生大量ATP。耐热蛋白2（PAP1987）、耐热蛋白3(PPA0030)、耐热蛋白4(PAP1006)在ABC转运系统中负责结合底物。耐热蛋白5（PAP0436）是TRAP转运系统的周质受体蛋白TAXI。耐热蛋白6（PAP0046）在生物体内参与嘌呤补救途径，此途径不仅补偿了高温生物合成核苷酸所需的嘌呤同时产生大量多胺。磷酸化的多胺与DNA和tRNA结合可以大大提高核酸的稳定性。采用Swiss-model模拟耐热蛋白6(PAP0046)的三维结构，并与SsMTAPⅡ（PDB编号:3T94）、hMTAP（PDB编号:1CB0）的三维结构比较。根据二硫键数目和位置、是否具有CXC motif和酶活位点疏水核心的紧密程度，预测耐热性由强到弱的顺序是:SsMTAPⅡ＞ PAP0046＞ hMTAP。菌株DY20341T存在2个MTAP蛋白，耐热蛋白6(PAP0046)与初古菌和泉古菌同源进化关系紧密，并具有的更加紧密的活性位点疏水核心，因此比更接近于变形菌和厚壁菌的MTAP(PAP1371)耐热。采用Real-time PCR的方法对6个耐热蛋白在不同温度培养条件下(80℃、90℃)的转录水平进行分析。在较高温度培养条件下，耐热蛋白1～6的转录水平依次上调了95倍、55倍、60倍、6倍、82倍和3.6倍。
　　 本文采用双向电泳的方法对菌株DY20341T在55℃、80℃和90℃条件下培养的蛋白质组进行分析，共发现了122个差异蛋白点。采用MALDI-TOF-TOF的方法鉴定了30个差异明显的的蛋白点，包括55℃与80℃相比上调表达的7个蛋白点，下调表达的6个蛋白点;90℃与80℃相比上调表达的12个蛋白点，下调表达的5个蛋白点。根据COG分类和蛋白生理功能分析结果，我们推测与菌株DY20341T生长温度适应性相关的蛋白主要参与了能量的产生与转换，还包括糖酵解途径、丙酮酸转化、氨基酸、核苷酸、ATP的合成与转运等。
　　 菌株DY20341T中有四个淀粉酶:淀粉酶1(PAP1794)属于糖苷水解酶GH-57家族，是一个4-α-葡聚糖转移酶。淀粉酶2(PAP0212)是胞外环糊精葡糖转移酶。淀粉酶3(PAP1770)和淀粉酶4(PAP0051)分别是GH-13家族的胞内和胞外α-淀粉酶。菌株生长12个小时后酶活力值达到最高值6.98U·L-1。四个淀粉酶在pH5.0，100℃条件下均有活性，并且反应不依赖钙离子，满足工业生产的要求。

目录

声明

摘要

前言

1 深海超嗜热菌的概况

2 嗜热菌耐热性的研究进展

2．1 细胞膜的耐热机制

2．2 核酸的耐热机制

2．3 蛋白的耐热机制

3 超热稳淀粉酶的研究进展

3．1 淀粉酶的种类

3．2 生产工艺中淀粉酶的应用

3．3 耐热α-淀粉酶和环糊精糖基转移酶

4 超嗜热古菌Palaecoccus pacificus DY20341T

第一章 菌株DY20341T耐热蛋白的初步探究

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 耐热蛋白的SDS-PAGE分离

3．2 耐热蛋白的质谱鉴定

3．3 耐热蛋白的转录水平分析

3．4 耐热蛋白参与的代谢通路

3．5 耐热蛋白6(PAP0046)耐热机制的分析

3．6 菌株DY20341T中两个MTAP的比较

4 讨论与小结

第二章 不同温度培养的菌株DY20341T的蛋白质组分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 菌株DY20341T温度差异蛋白点的COG分类

2．2 菌株DY20341T温度差异蛋白点的生理功能分析

3 讨论与小结

第三章 菌株DY20341T四个淀粉酶的异源表达与酶活分析

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 淀粉酶蛋白分子量的检测

3．2 淀粉酶在大肠杆菌中的克隆与表达

3．3 淀粉酶酶活分析

3．4 淀粉酶的氨基酸序列分析

4 讨论与小结

第四章 结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

致谢