深海超嗜热嗜压古菌Pyrococcus yayanosii压力适应性机制研究

摘要

深海是典型的高静水压环境,嗜压微生物(piezophile)是深海生态系统中的重要类群。随着深海取样技术的不断发展和深海高压微生物特殊培养装置的研发,已经从深海环境中分离到了多种嗜压微生物,其中包括不能在常压条件下生长的专性嗜压微生物。通过对分布于不同压力范围的微生物近缘种间进行比较而获得的嗜压微生物的压力适应性的认识,不能反映微生物个体水平上对静水压力变化的应激调控机制。本文通过比较严格嗜压菌株与其衍生的兼性嗜压菌株在基因组、转录组及相关生理性状上的差异,试图从微生物细胞的物质代谢与能量转化的角度分析深海嗜压微生物的压力适应性。
　　Pyrococcusyayanosii CH1分离自大西洋中脊4100米水深的“Ashadze”热液口,是目前已知的第一株和唯一一株严格嗜压的超嗜热古菌,其最适生长压力为52 MPa,最高耐受压力超过了120 MPa。本论文通过人工驯化手段,获得CH1衍生的兼性嗜压菌株A1,其最适生长压力为52 MPa,但压力耐受范围变宽,可以在0.1 MPa的常压条件下生长。对A1菌株进行全基因组测序,并与CH1进行比较基因组分析,结果表明两个基因组中存在23处序列差异,这些序列差异所在的基因主要与细胞周期调控、鞭毛的合成以及芳香族氨基酸的转运等相关。对A1菌株中相关基因的功能展开研究,将有助于揭示此类深海超嗜热嗜压古菌的压力适应性机制。
　　A1可以在常压下生长,使以该菌株为宿主建立遗传操作系统成为可能。构建了携带A1中pyrF基因侧翼同源序列和受谷氨酸脱氢酶强启动子控制的3-hydroxy-3-methylglutaryl辅酶 A(HMG-CoA)还原酶超表达基因元件(SimR)的自杀质粒pLMO02。利用过表达HMG-CoA还原酶赋予A1菌株simvastatin抗性作为标记,成功的中断了A1菌株的pyrF基因(PYCH0296),获得了尿嘧啶缺陷型菌株A2。而且,又构建了SimR-pyrF基因元件,获得了无痕基因中断载体pLMO03。无痕敲除系统突破了A1菌株中可用筛选标记的限制,可以中断A1基因组中的任何非必需基因,并且筛选标记可以重复利用。
　　单一菌株以甲酸为唯一碳源的产氢呼吸途径仅见于深海超嗜热古菌Thermococcus onnurineus NA1,是最简单的厌氧呼吸方式之一。比较基因组分析表明,Thermococcales科超嗜热古菌中只有 Thermococcus onnurineus NA1、Thermococcus gammatolerans EJ3和Pyrococcusyayanosii中存在有完整的甲酸代谢基因簇(Fmr)。中断A1菌株的Fmr基因簇后,突变株中大量积累甲酸,其0.1 MPa的生长也受到限制。膜结合态氢酶复合体 Mbh以及胞质内氢酶复合体SHI参与了Thermococcales微生物的能量代谢,中断A1菌株的Mbh和SHI基因簇后,突变株中也积累甲酸,表明Mbh和SHI复合体也参与了A1菌株的甲酸代谢。
　　甲酸既是代谢过程中的重要中间代谢产物,也是一些超嗜热微生物肌苷(IMP)合成途径中的一碳单元。对A1菌株在0.1 MPa和52 MPa压力条件下的转录组分析发现,与IMP合成途径相关的基因转录在0.1 MPa压力条件下调,而与甲酸代谢及能量转换相关的氢酶的编码基因则转录上调。该结果暗示,A1中参与IMP合成代谢的甲酸被分解产能以适应低压的胁迫环境。而对于CH1在15 MPa和52 MPa压力条件下的转录组分析发现,其在15 MPa的边界压力下,不能有效的调节甲酸由参与IMP合成向氧化产能转换。
　　进一步对 IMP合成途径和甲酸氧化途径相关基因的启动子区域分析,发现IMP生物合成途径中的多个基因的上游区域,存在有一个保守的 motif“CnTn5TGn3AAA”。以此 motif为探针,通过磁珠富集的方法获得了可以与该motif结合的转录因子(PTF)。转录组和蛋白组分析结果表明,A1菌株中甲酸代谢受压力调控的可能模型为:当A1处于52 MPa时,PTF高表达,并与IMP途径中相关基因的motif结合,激活IMP途径的表达。甲酸作为一碳单元,参与IMP的合成;而当A1处于0.1 MPa时,PTF的表达受到抑制,进而导致IMP合成受阻,引起甲酸的累积,而甲酸的大量积累又诱导了甲酸代谢基因簇的表达。
　　此外,在不同的温度、pH以及盐度胁迫条件下,A1菌株中的甲酸代谢基因簇也转录上调,该结果暗示在深海超嗜热嗜压古菌中通过调节甲酸代谢的流向,对其应对多重环境因子的胁迫具有重要意义。

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1 引 言

1.1 深海微生物压力适应性研究概况

1.2 Thermococcales研究概况

1.3 Thermococcales遗传操作系统

1.4 Pyrococcus yayanosii CH1介绍

1.5 本论文研究内容、目的、意义及困难

2 兼性嗜压菌株Pyrococcus yayanosii A1的分离及鉴定

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 小结与讨论

3 Pyrococcusyayanosii遗传操作系统构建

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 小结与讨论

4 Pyrococcus yayanosii CH1和A1不同压力下的转录组分析

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 小结与讨论

5 甲酸代谢与A1菌株的环境适应性研究

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4 小结与讨论：

6 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

附录

致谢

个人简历

攻读博士期间发表的学术论文