靶向Neuropilin-单克隆抗体抑制胶质瘤细胞U251对Fibronectin的粘附作用及其机制研究

摘要

研究背景和目的:
　　 脑胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤，大多数为浸润性和膨胀性生长，预后相对较差。据美国统计的资料显示，在所有胶质细胞瘤中约占半数的胶质母细胞瘤患者1年生存率约30％，5年生存率不到5％。尽管目前采取最大限度的手术切除及术后放疗与化疗结合等综合治疗，但是恶性胶质瘤(malignant gliomas，MG)的临床预后仍不乐观。目前分子靶向治疗已经成为近年来肿瘤治疗的热点，但是靶向治疗肿瘤的效果仍然十分有限，因此，发现新的肿瘤治疗靶点显得极为重要。人神经菌毛索1(Neuropilin-1，NRP-1)是一种新型的多功能受体，近年来，大量研究结果显示NRP-1可表达于新生血管的内皮细胞和多种肿瘤细胞，并参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等过程。研究表明，NRP-1在胶质瘤的各个发展阶段都有较高的表达，被认为是一个很有希望的治疗新靶点。本文旨在利用本实验室制各的抗NRP-1单克隆抗体针对胶质瘤细胞U251的粘附抑制作用及其机制做进一步的研究。
　　 实验方法:
　　 将杂交瘤细胞腹腔种植于Balb/c鼠、生产抗NRP-1单克隆抗体腹水，抗体用rProteinA亲和柱纯化，利用间接ELISA，Westernblot，流式细胞术和细胞免疫荧光染色对生产的单克隆抗体的特异性和亲和力进行检测。免疫印迹法(Western blot)及细胞免疫荧光检测NRP-1蛋白在胶质瘤细胞株U251的表达。通过粘附实验研究NRP-1单克隆抗体对胶质瘤细胞株U251粘附的影响。通过共聚焦荧光显微镜观察罗丹明-鬼笔环肽染色后NRP-1单克隆抗体对胶质瘤细胞株U251应力纤维的形成的影响。通过免疫共沉淀、westemblot研究NRP-1单克隆抗体对胶质瘤细胞株U251作用后粘附于FN因子上相关蛋白含量的变化。
　　 实验结果:
　　 结果显示，我们制备的抗NRP-1抗体纯化后纯度高达95％，浓度为4mg/ml。Western Blot实验显示抗体能特异识别胶质瘤U251细胞中的NRP-1蛋白;细胞免疫荧光染色显示NRP-1 MAb定位于胶质瘤U251细胞膜上。粘附实验表明抗NRP-1抗体对胶质瘤U251具有粘附抑制的作用。通过共聚焦荧光显微镜、免疫共沉淀、western blot实验发现，抗NRP-1抗体可以抑制粘附的胶质瘤U251细胞的应力纤维的形成，影响整合素α5β1与NRP-1复合物的形成，降低FAK、p130cas的磷酸化水平。
　　 结论:
　　 本实验成功制备了高纯度和高特异性的NRP-1 MAb;粘附实验结果表明抗NRP-1抗体对胶质瘤细胞U251具有粘附抑制的作用，并且这个作用和抑制NRP-1与整合素α5β1相互结合从而导致FAK/p130cas信号通路受到抑制有关。

目录

声明

摘要

前言

一、胶质瘤发病机制

1．干细胞

2．基因学方面

二、胶质瘤的病理生理

三、胶质瘤的治疗现状

1．手术治疗

2．放射治疗

3．化学治疗

4．免疫治疗

5．肿瘤的靶向治疗

6．其他治疗

四、Neuropilin-1研究进展

1．Neuropilin-1的结构及分布

2 Neuropilins的共受体

3 Neuropilin-1的功能

五、研究目的与内容

第一章 抗NRP-1单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

一、材料和方法

1．材料

2．方法

二、结果与分析

1．抗体纯度的测定

2．抗体的滴度的测定

3．细胞免疫荧光分析

三、讨论

第二章 抗NRP-1抗体抑制胶质瘤细胞U251粘附能力的研究

一、材料和方法

1．材料

2．实验方法

二、结果与分析

三、讨论

第三章 抗NRP-1抗体抑制神经胶质瘤细胞U251粘附机制研究

一、材料和方法

1．材料

2．方法

二、结果与分析

1．抗NRP-1抗体抑制细胞骨架蛋白形成

2．抗NRP-1抗体抑制整合素α 5 β 1与NRP-1蛋白结合

3 抗NRP-1抗体抑制FAK、p130cas的磷酸化

三、讨论

第四章 结论与本文存在的问题及今后应开展的研究

一、结论

二、本文存在的问题及今后应开展的研究

参考文献

致谢