大肠杆菌噬菌体的分离纯化及其在海水养殖中的应用

摘要

噬菌体是一类感染原核生物的病毒，在自然界中广泛分布，种类繁多。近年来，由于养殖业多采用高密度培养以及抗生素的滥用，导致大量耐药菌株出现，噬菌体作为一种更有效的治疗手段，正越来越受到关注。本文运用直接法在厦门港、演武大桥桥头排污口、厦门大学南大沟、芙蓉湖、珍珠湾等处进行采样，经菌悬液富集后，以双层琼脂平板法和液体纯化法分离纯化出2株大肠杆菌裂解性噬菌体EX01、EX02，进行宿主感染试验，测定了EX01低温保存的效价和一步繁殖曲线，并使用EX01分别处理生活污水，预处理养殖用水，处理养殖中期用水和青蟹暂养海水。其结果将为海水养殖病害防治提供资料，具有重要理论意义和应用价值。主要结果如下: 1、以大肠杆菌为宿主，从自然水体中分离得到2株大肠杆菌裂解性噬菌体EX01和EX02。经电镜观测，EX01为蝌蚪状具可收缩尾的噬菌体，其头部为三十面体，约70×110 nm，尾部长约100～130 nm，尾宽约18～22 nm，有尾鞘、基板、尾丁、尾丝等结构，隶属肌尾病毒科(Myoviridae)。EX02为短尾噬菌体，其头部为二十面体，大小为20 nm，尾部长约2～3 nm，隶属短尾病毒科(Podoviridae)。 2、使用噬菌体EX01和EX02对5株不同细菌进行宿主感染试验，结果显示EX01能感染工程菌E.coli DH5α和另外2株分离自生活污水的大肠杆菌(E.coli S1和E.coli S2)，是一株广谱噬菌体;EX02仅能感染E.coli S2。EX01和EX02均无法感染弧菌W(Vibrio sp.)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putica)。 3、针对噬菌体EX01进行低温保存的效价试验，噬菌体以悬液形式分装-18℃保存，每7d测定一次，直至检测不到噬菌体。结果显示悬液低温保存法能保存噬菌体30 d以上，保存的56d内EX01仍然具有感染性。 4、测定噬菌体EX01感染大肠杆菌E.coli S1的一步繁殖曲线，结果表明，EX01的潜伏期在25 min左右，裂解期为25～35 min。在15 min内吸附率为85.6％，裂解完成后平均裂解量为135.05。 5、利用效价为1.81×108 pfu·mL-1的噬菌体EX01处理生活污水1h，结果显示总菌数减少34.6％，大肠杆菌数减少89.0％。 6、利用噬菌体EX01预处理新鲜未使用的养殖海水，处理前后均未检出细菌，表明该海水经过过滤预处理，含菌量极低，适合进行养殖活动。 7、利用效价为1.47×108 pfu·mL-1的噬菌体EX01处理采自牡蛎育苗缸的养殖中期用水1h，结果显示总菌数减少了13.3％，大肠杆菌数减少82.4％。 8、利用效价为1.04×108pfu·mL-1的噬菌体EX01处理青蟹暂养海水1h，结果显示总菌数增加7.7％左右，大肠杆菌数减少98.3％。 9、将噬菌体EXO1的效价设置为7.02×102 pfu·mL-1，7.02×103 pfu·mL-1，…，7.02×106pfu·mL-1，分别处理青蟹暂养海水，取样时间为1h、2h、3h。结果显示在同一效价条件下，总菌数随着处理时长的增加而增加，大肠杆菌数随着处理时长增加呈下降趋势，且在降低98～99％后维持稳定。在同一时长条件下，总菌数随着噬菌体效价增加先减小后增加，最小值对应的效价为7.02×103 pfu·mL-1，大肠杆菌数随着噬菌体效价增加呈下降趋势，且在降低98～99％后维持稳定。 以上结果表明，EX01能有效降低水环境中大肠杆菌浓度，具有应用于水产养殖的潜力。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 噬菌体的生物学特性简介

1．1．1 噬菌体的发现及其名称的由来

1．1．2 噬菌体的分类与作用机制

1．2 国内外相关研究动态

1．2．1 噬菌体的分离纯化方法

1．2．2 噬菌体在生物防治方面的应用

1．2．3 噬菌体用于水产养殖面临的问题

1．2．4 噬菌体应用的发展趋势

1．3 本研究的主要内容和基本思路

1．3．1 科学问题的提出

1．3．2 本研究的主要内容

1．3．3 本研究的基本思路

1．4 本研究的目的和意义

1．4．1 目的

1．4．2 意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 宿主菌的来源

2．1．2 水样的来源

2．1．3 培养基

2．2 器材

2．3 实验方法

2．3．1 宿主菌的分离纯化

2．3．2 菌悬液的制备

2．3．3 噬菌体的分离纯化

2．3．4 噬菌体的形态观察

2．3．5 高效价噬菌体的制备

2．3．6 噬菌体的宿主感染

2．3．7 噬菌体低温保存的效价测定

2．3．8 噬菌体一步繁殖曲线的测定

2．3．9 噬菌体处理生活污水

2．3．10 噬菌体预处理养殖用水

2．3．11 噬菌体处理养殖中期用水

2．3．12 噬菌体处理青蟹暂养海水

2．3．13 不同时长不同效价噬菌体处理青蟹暂养海水

第三章 结果与分析

3．1 宿主菌的分离纯化与形态观察

3．2 噬菌体的分离纯化与形态观察

3．2．1 噬菌体的分离纯化

3．2．2 噬菌体的形态观察

3．3 噬菌体的宿主感染

3．4 噬菌体低温保存的效价测定

3．5 噬菌体的一步繁殖曲线

3．6 噬菌体处理生活污水结果

3．7 噬菌体预处理养殖用水结果

3．8 噬菌体处理养殖中期用水结果

3．9 噬菌体处理青蟹暂养海水结果

3．10 不同时长不同效价噬菌体处理青蟹暂养海水结果

第四章 讨论

4．1 分离噬菌体的方法探讨

4．2 噬菌体保存效果的探讨

4．3 噬菌体的宿主谱与治疗效能的关系

4．4 噬菌体用于处理生活污水的探讨

4．5 噬菌体用于处理养殖用水的探讨

4．6 环境中噬菌体与宿主菌的消长关系

4．7 噬菌体对人体的安全性探讨

4．8 水产养殖病害的综合防治

4．8．1 多品种混养

4．8．2 浮游微藻调控

4．8．3 拮抗菌

4．8．4 免疫药物

第五章 结语

5．1 主要研究成果

5．2 创新和特色

5．3 不足之处

5．4 展望

参考文献

在学期间参与的科研活动和发表的文章

致谢

附录一 在学期间的主要科研成果