1,25(OH)2D3联合单克隆抗体延长小鼠加速性排斥模型中心脏移植生存期的研究

摘要

目的:供者反应性记忆性T细胞(Tm)介导加速性排斥反应，是诱导移植物耐受的主要障碍。本研究利用1，25(OH)2D3和封闭性单克隆抗体anti-CD154/anti-LFA-1对Tm介导的加速性排斥反应进行治疗，比较不同用药组合对移植物的保护作用并探索该方案的作用机制。
　　 方法:首先通过同种异体皮肤移植得到预致敏小鼠，过继转移同种反应性记忆性T细胞，构建小鼠同种异体心脏移植模型后再联合1，25(OH)2D3和anti-CD154/anti-LFA-1进行治疗，观察移植物生存期的改变，并从移植物和模型鼠整体两个角度探讨其可能的作用机制;之后以同种异体皮肤移植预致敏小鼠为受体进行心脏移植（二次移植模型），联合1，25(OH)2D3和anti-CD154/anti-LFA-1进行治疗并观察其生存期。采集二次移植受体鼠脾脏、血清及移植物标本，探讨其可能的作用机制。
　　 结果:在过继转移模型中，(1)预致敏小鼠脾脏T细胞中含有大量表型为CD44highCD62Llow的记忆性T细胞，其中CD4+Tm占58.56％，CD8+Tm占49.04％，未致敏小鼠CD4+Tm占16.49％，CD8+Tm占14.19％;(2)1，25(OH)2D3及Ab单独或联合应用进行短期干预实验，结果得到各组平均存活时间分别为HTx control组6.5d，Ab组23.5d，1，25(OH)2D3组15.5d，Ab+1，25(OH)2D3联合用药组80d。术后各组之间体重无明显差异;(3)各组治疗后第5天和第20天处死动物，对心脏移植物进行了病理学检测:各组之间相比较，对照组发生了严重的淋巴细胞浸润和组织结构的破坏，1，25(OH)2D3组和Ab组显示了中等程度的淋巴细胞浸润和组织结构的破坏，而联合组淋巴细胞浸润和组织破坏的程度最轻;(4)在心脏移植后第5天和第20天，收集各组移植物和血清，对各组移植物和血清中与排斥相关的细胞因子表达水平进行检测。从统计分析当中可以看出1，25(OH)2D3和联合组心脏移植物和血清中的IL-2、IFN-γ和IL-10的相对表达水平都明显下调。而TGF-β表达水平升高，Foxp3基因的表达水平升高，说明1，25(OH)2D3和联合组都能上调移植物中Tregs的表达水平，而联合组效果最佳;(5)过继转移移植后应用1，25(OH)2D3单独及联合Ab治疗，通过流式细胞术检测各组脾脏中记忆性T细胞及调节性T细胞(Tregs)表达水平;通过MLR检测各组脾脏T细胞同种异体反应能力。发现1，25(OH)2D3单独及联合Ab治疗均可明显减弱脾脏记忆性CD4+和CD8+T细胞的比例和同种异体反应能力。停药后移植物能长期存活，可能由于诱导产生大量Tregs有关。在预致敏小鼠二次移植模型中，(6)各组平均生存期为HTx allo-primed ctrl组3d，Ab组5.5d，1，25(OH)2D3组7d，联合组19d;组织学检测可以观察到，与对照组比较，联合用药方案明显阻止了淋巴细胞对移植物的浸润;(7)移植物中相关基因相对表达量的检测表明:联合用药方案可显著降低移植物中排斥相关基因IL-2和IFN-γ的表达量，上调TGF-β的相对表达量而下调IL-10的相对表达量。联合用药组治疗后，二级淋巴器官脾脏中CD4+Tm和CD8+Tm细胞比例均出现不同程度地减少，同时其活化增殖、免疫辅助的功能也被抑制。移植后5天时，联合用药组表现为诱导Foxp3基因的高表达和脾脏中Tregs比例的升高;(8)虽然联合用药组明显减少血清中同种异型抗体表达水平，但是一旦停药，移植物仍被迅速排斥。
　　 结论:在过继转移同种反应性记忆性T细胞的移植模型中，联合阻断效应及记忆性T细胞可获得移植物长期存活，其机制可能是对Th1的抑制作用，而联合用药方案更能诱导Th1向Th2型细胞转换。联合用药方案明显降低移植物和移植受者细胞免疫应答水平的同时，诱导移植物中表达大量TGF-β分泌性Th3细胞，增加调节性T细胞的比例;而在二次心脏移植模型中，抑制效应及记忆性T细胞虽可明显延长移植物生存期，但并不能有效诱导移植物长期存活，推测记忆性B细胞可能是诱导二次移植免疫耐受的重要障碍，此问题有待进一步研究。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 T细胞与心脏移植

1．2 T细胞与移植耐受

1．3 Tm细胞在移植中的作用

1．4 1，25(OH)2D3对器官移植的免疫调节作用

1．5 本研究的目的、意义和内容

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

第三章 1，25(OH)2D3联合单克隆抗体延长过继转移模型小鼠心脏移植物生存期的研究

3．1 过继转移预致敏T细胞的纯度和Tm的比例

3．2 联合用药对过继转移记忆细胞小鼠心脏移植物存活时间及体重的影响

3．3 各组移植物的病理学分析及评分

3．4 移植物中相关细胞因子表达水平

3．5 血清中相关细胞因子的检测(CBA和ELISA检测)

3．6 各组脾T细胞同种异型应答能力(MLR)

3．7 各组脾Tm细胞、Tregs表达水平(FCM)

3．8 血清中供者特异性抗体含量的检测

3．9 讨论

第四章 1，25(OH)2D3联合单克隆抗体延长二次移植模型中小鼠心脏移植物生存期的研究

4．1 联合用药对二次移植模型小鼠心脏移植物存活时间及体重的影响

4．2 各组移植物的病理学分析及评分

4．3 移植物中相关细胞因子表达水平

4．4 血清中相关细胞因子的检测(CBA和ELISA检测)

4．5 各组脾T细胞同种异型应答能力(MLR)

4．6 各组脾Tm细胞、Tregs表达水平(FCM)

4．7 血清中供者特异性抗体含量的检测

4．8 讨论

第五章 结论与展望

5．1 本论文的研究主要得到以下结论

5．2 展望

参考文献

附录

附录一 示图索引

附录二 表格索引

附录三 缩略语及中英文对照

附录四 攻读博士期间发表文章、参与课题及学术活动

致谢