FLASH可能作为下游靶基因参与HoxB4调控斑马鱼胚胎早期造血作用机制的研究

摘要

目的:研究FLASH基因在野生型斑马鱼胚胎发育早期的表达情况，并与HoxB4高表达的转基因系斑马鱼比较FLASH基因表达的差异，从而为研究FLASH基因在HoxB4基因增强造血干细胞的自我更新机制中可能的作用奠定重要基础。
　　方法:收集0.75-72hpf多个时相的Tubingen野生型斑马鱼胚胎，用TRIZOL法提取斑马鱼胚胎总RNA后，采用RT-PCR方法克隆斑马鱼FLASH基因片段，将得到的FLASH基因片段和pCS2+质粒经BamHⅠ及HindⅢ双酶切后插入pCS2+质粒中，通过对重组质粒进行双酶切及插入片段测序鉴定后，经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的FLASH基因反义mRNA探针;选取Tubingen野生型斑马鱼（WT空白对照组）0.75-72hpf（hours post fertilization，hpf，受精后）胚胎，转基因对照组(TG:zLmo2-Cre;zLmo2-LDEL-EGFP)18-72hpf，功能组(TG:zLmo2-Cre;zLmo2-LDEL-HoxB4-EGFP)18-72hpf。用FLASH基因反义mRNA探针经斑马鱼全胚胎原位杂交研究斑马鱼胚胎发育过程中FLASH基因的表达及在斑马鱼体内过表达HoxB4基因对FLASH基因表达的影响。在体视显微镜下观察并记录结果。
　　结果:采用RT-PCR等相关技术克隆获得了斑马鱼胚胎FLASH基因片段，经基因重组技术以及酶切、测序鉴定证明得到了FLASH-pCS2+重组质粒并进一步制备了FLASH反义mRNA探针，经过斑马鱼全胚胎原位杂交检验了FLASH基因反义mRNA探针的有效性，观察到Tubingen野生型斑马鱼3.7hpf、9-24hpf的神经外侧板、头部和脊索及18-30hpf的原肾管可见黑色的阳性杂交信号，36hpf后各实验组与WT对照组均未见FLASH基因表达。Tubingen-WT组18-72hpf与对照组转基因系（TG:zLmo2-Cre;zLmo2-LDEL-EGFP)18-72hpf之间未见明显差异，功能组(TG:zLmo2-Cre;zLmo2-LDEL-HoxB4-EGFA18-30hpf与Tubingen-WT空白组18-30hpf之间在神经系统、造血系统可见明显差别，结果显示功能组(TG:zLmo2-Cre;zLmo2-LDEL-HoxB4-EGFP)18-30hp之间在神经系统、造血系统FLASH的表达发生了下调。
　　结论:成功构建了FLASH-pCS2+重组质粒及FLASH基因反义mRNA探针。了解了FLASH基因在Tubingen野生型斑马鱼胚胎早期的表达情况，从而为研究FLASH基因相关功能奠定一定的基础。FLASH基因在造血系统中可能是HoxB4基因的下游靶基因，并且可能在神经系统的发育中起到了重要作用。

目录

摘要

前言

材料和方法

1、主要材料

2．实验方法

3．实验地点

结果

1、Tubingen鱼系野生型胚胎总RNA提取

2．FLASH-pCS2+重组质粒的构建结果

3．FLASH基因在Tubingen野生型斑马鱼全胚胎原位杂交结果

讨论

1．FLASH基因在野生型斑马鱼发育早期的表达模式

2．HoxB4与FLASH基因间的协调作用对斑马鱼造血系统发育的影响

参考文献

致谢

缩略语表

声明

附1、FLASH基因研究进展

附2 已被第三军医大学学报录用发表的文章