深海产油菌株近平滑假丝酵母2A00015(Candida parapsilosis)的选育及其制备微生物柴油的初步探讨

摘要

微生物油脂(microbialoils)又称单细胞油脂(singlecelloil，SCO)，即微生物以碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐生产的油脂和另一些有商业价值的脂质。随着人口的增长、社会的进步使油脂需求量与自然资源短缺的矛盾日益加剧，环境污染日趋严重，开发新型油脂资源及清洁能源是当务之急。微生物生产油脂具有原料来源丰富、可再生、成本低、周期短、环境友好等优点，已引起人们的高度关注。开展微生物油脂的研究对解决人类面临的资源短缺、环境恶化等现实问题具有重要意义。
　　 本文针对当前所关注的有关深海微生物、生物能源、废物综合利用3个热点问题，旨在寻找一株可以高效利用廉价碳源糖蜜发酵生产微生物油脂的菌株。大多数产油酵母在葡萄糖培养基中生长旺盛，产油率高，而在糖蜜培养基中，生长缓慢，甚至不能生长，且其产油率也大幅度下降。近平滑假丝酵母2A00015（Candidaparapsilosis）不仅在葡萄糖培养基中生长旺盛，具有稳定的产油能力（油脂含量5.89g/L），然而，在糖蜜培养基中依然生长旺盛且产油能力（产油含量5.07g/L）未发生太大变化。本文以2A00015作为出发菌株开展相应的研究。
　　 主要研究结果如下:
　　 为进一步提高产油酵母2A00015的产油效率，本文对其提取原生质体后紫外诱变，经过初筛和复筛，筛选出可高效利用廉价有机碳源生产微生物油脂的突变菌株2A00015/25;其以糖蜜作为发酵底物，油脂产量为7.39g/L，较原始菌株提高了45.68％。
　　 采用酸热法破碎菌体后提取突变菌株2A00015/25的胞内油脂，并对其产油能力进行评价，通过对油脂进行甲酯化后采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)测定其脂肪酸组成。结果表明，酵母2A00015/25的产脂能力较强，油脂含量达菌体干重的41.61％;脂肪酸组成中，油酸含量较高，占脂肪酸总量的63.83％，显示了其具有较高的油酸生产潜能，因此其可作为功能性油脂微生物被开发利用。
　　 对突变菌株2A00015/25的发酵产油脂培养条件进行优化，从影响产油能力的各因素进行单因素分析后，对其中影响较大的因素做了正交实验进一步优化，确定了突变菌株2A00015/25的最佳产油摇瓶发酵培养基为:糖蜜（总糖浓度）70g/L，硫酸铵1g/L，酵母粉0.25g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2.0g/L;最优培养条件为:初始pH5.5，发酵温度28℃，摇床转速150rpm，装液量50mL/250mL，接种量10％，发酵时间120h。并在最佳发酵条件下做了验证性实验，生物量和油脂含量分别达到19.49g/L，9.95g/L，分别提高9.70％、34.63％。
　　 对微生物油脂催化制备生物柴油的三种方法，碱催化化法、固定化酶催化法及离子液体催化法进行研究:利用正交实验确定碱催化法的最佳催化条件;筛选出最佳的固定化酶及载体，并对其催化条件进行摸索;对合成获得的三种离子液体[BMIm]Cl、[BMIm]BF4和[BMIm]PF6进行结构表征确定其结构后，并对其催化条件进行摸索。研究表明碱催化法的转化率为94％，固定化酶法的转化率为65％，而离子液体[BMIm]PF6催化酯交换产率可达95％以上，并且相较于其他两种离子液体具有更高的催化活性和产率，经过简单处理可循环使用6次以后，仍保持较高的催化活性，符合绿色化学的要求，具有良好的工业化应用前景。
　　 最后，对油脂各成分及其对应的含量进行分析，其不饱和脂肪酸甲酯含量远高于饱和脂肪酸甲酯含量;其油脂成分和大豆油相似，适合用于制备生物柴油。并对生成的生物柴油进行理化指标的检测，达到生物柴油的欧洲标准EN-14214的要求。

目录

声明

摘要

1．绪论

1．1 微生物油脂概述

1．1．1 国内外研究现状

1．1．2 微生物油脂开发优势及局限性

1．1．3 微生物油脂组成

1．2 产油脂微生物

1．2．1 产油微生物具备条件

1．2．2 产油微生物种类

1．3 微生物油脂的生物合成及影响因素

1．3．1 微生物油脂的生物合成

1．3．2 产油微生物油脂合成的影响因素

1．4 微生物油脂生产工艺

1．4．1 微生物油脂的生产原料

1．4．2 菌体的预处理

1．4．3 菌体中油脂的提取

1．4．4 油脂精炼

1．5 微生物油脂的应用研究现状

1．5．1 产油微生物在生理功能中的应用前景

1．5．2 产油微生物在生物柴油生产中的应用前景

1．6 微生物油脂制备柴油

1．6．1 生物柴油简介

1．6．2 生物柴油制备方法

1．7 本课题研究意义、研究内容及技术路线

1．7．1 本课题研究目的及意义

1．7．2 研究内容及技术路线

2．材料与方法

2．1 实验材料

2．2 常用溶液配方

2．3 基本方法

3．结果与分析

3．1 产油酵母诱变、筛选及分析

3．1．1 2A00015原生质体紫外诱变剂量效应曲线及诱变剂量的选择

3．1．2 2A00015突变株的初筛

3．1．3 2A00015突变株的复筛

3．1．4 遗传稳定性试验

3．1．5 2A00015／25诱变菌株形态学特征

3．1．6 酸热法提取2A00015／25菌株的油脂

3．1．7 2A00015／25油脂成分分析

3．1．8 本节小结

3．2 糖蜜培养基产脂发酵优化

3．2．1 菌株2A00015／25生长曲线的测定

3．2．2 菌种种龄对产油脂的影响

3．2．3 碳源浓度对产油脂的影响

3．2．4 氮源对产油脂的影响

3．2．5 硫酸镁对产油脂的影响

3．2．6 磷酸二氢钾对产油脂的影响

3．2．7 接种量对酵母2A00015／25生长及产脂影响

3．2．8 溶氧量对酵母2A00015／25生长及产脂影响

3．2．9 初始pH对酵母2A00015／25生长及产脂影响

3．2．10 产油酵母2A00015／25生长及产油最佳发酵条件的优化

3．2．11 验证性实验

3．2．12 本节小结

3．3 利用微生物油脂制备生物柴油

3．3．1 碱催化微生物油脂合成生物柴油工艺的优化

3．3．2 固定化酶催化微生物油脂合成生物柴油

3．3．3 离子液体催化微生物油脂合成生物柴油

3．3．4 生物柴油成分的分析及理化指标的检测

3．3．5 本节小结

4．讨论

4．1 高产油菌株诱变育种

4．2 产油脂诱变菌株的筛选

4．3 诱变菌株生产的油脂在生理功能中的应用

4．4 利用糖蜜生产油脂的成本优势

4．5 产油酵母培养基优化

4．6 微生物油脂制备生物柴油的探讨

5．创新与展望

5．1 创新

5．2 展望

参考文献

致谢