一种针对卵巢癌相关肿瘤标志物CA125的管式化学发光检测方法的建立

摘要

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其死亡率占妇科恶性肿瘤之首。由于卵巢癌早期临床症状具有隐匿性，导致早期不易被发现，约70％的患者在就诊时已是临床晚期，错过了最佳治疗时期。临床数据显示晚期卵巢癌患者的五年生存率仅20％，而早期卵巢癌患者的五年生存率可以达到80％。因此，建立卵巢癌的早期诊断方法非常重要，有助于指导卵巢癌患者进行早期治疗，从而降低卵巢癌病死率，对提高我国人民健康水平具有重要意义。
　　 血清肿瘤标志物(Tumor marker)联合检测是肿瘤早期诊断的一种有效方式。卵巢癌相关的肿瘤标志物包括CA125、HE4、CEA等，其中CA125是临床使用最广泛的卵巢癌肿瘤标志物，是卵巢癌血清肿瘤标志物检测的“金标准”，临床上被广泛应用于卵巢癌的早期诊断、预后评估和治疗后病情监测。CA125是一种高分子量和高糖基化的糖蛋白，给制备CA125抗原和抗体带来挑战。因国内未能研制出CA125抗原及其抗体，目前我国的CA125诊断试剂或其核心原料全部依赖进口。进口试剂的昂贵成本，导致临床上无法开展CA125的常规筛查，不利于卵巢癌患者的早期诊断。因此，研制针对CA125的国产高性能诊断试剂，有利于降低卵巢癌的检测成本，推动我国卵巢癌患者的早期筛查和治疗后监测，对降低我国卵巢癌病死率具有重要意义。为此，本研究拟通过制备CA125抗原和抗CA125单克隆抗体（单抗），进而建立适合自动化高通量管式化学发光检测系统的高灵敏度、高特异性的CA125检测方法为卵巢癌早期诊治及临床研究提供有用的工具。主要研究结果如下:
　　 第一，证明原核表达的CA125抗原因构象性问题不适合制备CA125单抗。首先，通过原核表达的方式对文献报导的CA125单抗识别的表位区，即N端156aa的重复区段和重复区段内保守区段21aa(aa59-79)，进行了重组表达;其次，利用上述方法获得的重组表达抗原对Balb/C小鼠进行免疫;最后，用进口商品化CA125天然抗原检测上述小鼠免疫血清，发现CA125重组表达抗原免疫小鼠血清对天然CA125抗原不反应，提示CA125单抗识别表位具有构象依赖性，原核表达方式较难获得具有天然构象的CA125抗原，为后续建立生化提取方法制备有天然构象的CA125抗原指明了方向。
　　 第二，CA125天然抗原的制备与鉴定。首先，建立了高氯酸沉淀法提取卵巢癌患者腹水中的CA125的粗纯化方法。通过条件摸索，确定过高的酸浓度与碱中和反应都是影响CA125得率的主要因素，最佳的高氯酸使用浓度为0.22mol/L，不仅可以有效去除大量杂蛋白而且粗纯的CA125得率可以从原来的9％提高到38％;然后，利用HPLC-G5000分子筛层析方法对CA125粗纯品进行了精纯，发现在10-12min时间段收集的样品不仅纯度高且活性好，可达到23KU/ml，其抗原性与商品化CA125检测试剂盒中的CA125活性基本一致。总之，本研究建立了一种CA125抗原的生化提取方法，获得了高纯度的CA125天然抗原，为制备CA125单抗提供了关键的活性抗原。
　　 第三，抗CA125单抗的制备与鉴定。首先，利用不同剂量的CA125抗原和肿瘤细胞免疫Balb/C小鼠，发现细胞免疫和低剂量CA125抗原免疫都难以刺激出较高滴度的免疫血清，当剂量＞10KU时才可以刺激出较高滴度的免疫血清;其次，建立了适合CA125单抗筛选的间接ELISA方法，确定CA125抗原的最低有效包被剂量为2U/well;最后，经过融合筛选，获得20株针对CA125的特异性单抗，ELISA显示上述单抗对天然CA125抗原有较好的反应活性。
　　 第四、CA125管式化学发光检测方法的建立和性能评价。首先，利用微粒磁珠作为固相包被载体，吖啶酯作为化学发光标记物，分别对CA125单抗进行磁珠偶联及标记;其次，将包被抗体和标记抗体进行两两配对，筛选得到9个灵敏度较高的单抗配对，检测范围可达:＞250U/ml-0.5 U/ml;然后，用临床人血清标本评估9个配对单抗的检测特异性，结果显示本研究建立的CA125化学发光检测方法对卵巢癌患者具有较好的检测特异性，其检测效果与雅培公司生产的商品化CA125诊断试剂的检测相关性良好（R值＞0.99）。
　　 综上所述，本研究成功建立了CA125天然抗原的制备工艺，利用获得的CA125天然抗原制备出CA125特异性单抗，进而筛选出适合管式化学发光检测系统的CA125单抗配对，建立了CA125检测方法，其检测性能与进口CA125诊断试剂相当，该原料和方法的建立有望打破我国卵巢癌诊断用的CA125检测试剂长期受进口试剂所垄断的局面，为建立国产商品化CA125诊断试剂奠定基础。

目录

声明

摘要

缩写词

前言

1．卵巢癌概述

1．1 卵巢癌流行病学特征

1．2 卵巢癌的临床特征

1．3 卵巢癌的治疗

1．4 卵巢癌的临床诊断

2．卵巢癌相关肿瘤标志物CA125概述

2．1 肿瘤标志物在肿瘤诊断中的应用现状

2．2 卵巢癌相关的肿瘤标志物及其应用情况

2．3 CA125(carbohydrate antigen125)介绍

2．4 CA125(MUC16)的生物学性质

2．5 适用于血清CA125检测的方法学

3．本论文的研究意义及主要研究内容

材料与方法

1．1 主要仪器

1．2 主要耗材

1．3 主要试剂与实验动物

1．4 常用溶液和培养基的配制

1．5 实验方法

结果与分析

1．CA125抗原的制备

1．1 CA125表位区重组蛋白的制备与鉴定

1．2 CA125天然抗原的提取及鉴定

2．CA125单克隆抗体的筛选及制备

2．1 免疫条件与抗原包被剂量的摸索

2．2 CA125单克隆抗体的制备及纯化

2．3 CA125单抗活性鉴定

3．CA125管式化学发光试剂的开发

3．1 CA125管式化学发光检测系统抗体配对初步筛选

3．2 初筛配对的灵敏度评价

3．3 CA125化学发光检测系统特异性及相关性分析

讨论

1．建立合适的CA125抗原制备方法是本研究取得成功的关键环节

2．CA125单克隆抗体的制备

3．管式化学发光检测技术具有良好的应用前景

4．未来工作展望

小结

参考文献

致谢