家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽MAF-1抗真菌机制初探

摘要

目的:制备家蝇幼虫血淋巴中的抗真菌肽，对其进行结构与功能分析及抗真菌机制研究。
　　方法:1、家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽的制备:采用剪头法提取家蝇幼虫血淋巴;固相萃取、高效液相色谱分析、纯化家蝇幼虫血淋巴;采用微量液体-菌落记数法检测经RP-HPLC分离纯化得到的抗真菌肽抗白假丝酵母菌活性;对经RP-HPLC纯化后的抗真菌肽进行SDS-PAGE分析，并初步测定抗真菌肽的分子量。2、结构与功能分析:制备的抗真菌肽MAF-1在100℃30min、1h和2％、5％SDS条件下通过圆二色谱和活性检测探索其结构与功能的关系。3、机制研究:利用扫描电镜观察细胞形态变化，紫外分光光度计观测细胞通透性变化及单细胞凝胶电泳(SCGE)观察细胞内DNA损伤情况。
　　结果:1、50％乙腈萃取洗脱组分经RP-HPLC分析，在31.85min处均出现一响应值较高、分离度较好的蛋白峰;从SDS-PAGE图谱上观察此峰在SDS-PAGE图谱上仅显示一个条带，达到了电泳纯，且测得其分子量为17.136kDa;此峰在220nm处有最高吸收，在280nm处也有一定吸收，符合蛋白肽类物质的吸收光谱;微量液体-菌落记数法检测结果显示:此洗脱蜂具有抗真菌活性;经鉴定此峰即家蝇抗真菌肽-1（Muscadomestica antifungal peptide，MAF-1）;2、通过圆二色谱测出水溶液中抗真菌肽MAF-1主要以α螺旋及β折叠为主，无规卷曲的构象也存在;物理煮沸和化学变性剂SDS的加入，对β折叠结构影响较大，活性相应降低。3、白假丝酵母菌经抗真菌肽作用后，与对照相比紫外吸收值明显升高，且随着作用时间的延长呈现上升趋势，相应的渗透率大幅度提高;4、扫描电镜观察结果显示:经抗真菌肽作用1h后的部分真菌出现表面凸凹不平，细胞结构模糊;随着作用时间的延长，表面形成很明显的凹陷，皱缩，个别菌体破裂，原生质严重扩散，内容物外泄，病变真菌发生率高于对照组;5、单细胞凝胶电泳结果显示:正常对照组的真菌呈现典型的圆形，而实验组则出现明显的拖尾现象即形成“彗星”样细胞特征，即很小的彗星头，大而圆的彗星尾，细胞迁移距离明显高于对照组;6、电泳图谱显示，抗真菌肽MAF-1作用后的白假丝酵母菌菌体蛋白谱带某些条带明显变浅，条带数下降，甚至消失。
　　结论:1、通过圆二色谱测出水溶液中抗真菌肽MAF-1主要以α螺旋及β折叠为主，无规卷曲的构象也存在;物理煮沸和化学变性剂SDS的加入，对β折叠结构影响较大，活性相应降低。2、通过电镜，SCGE等方法研究抗真菌肽对白假丝酵母菌的作用机制，表明其可能使真菌表面形成许多突起，凹陷，细胞壁逐渐裂解，导致细胞形状不规则;改变细胞膜的通透性，在细胞膜上形成了许多孔道，使菌体内容物外泄;抗真菌肽也可能通过破坏真菌细胞DNA，阻碍基因表达及蛋白的合成发挥抗菌作用，最终造成真菌死亡。

目录

摘要

前言

1 材料

1．1 虫种

1．2 菌株

1．3 主要试剂及耗材

1．4 主要仪器设备

2 方法

2．1 家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽MAF-1的制备

2．2 MAF-1结构与功能分析

2．3 抗真菌肽抗真菌机制初探

2．4 统计学分析

3 结果

3．1 高效液相色谱分析固相萃取50％洗脱组分

3．2 抗真菌活性检测结果

3．3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果

3．4 MAF-1功能与结构的关系

3．5 聚丙烯酰胺凝胶电泳观察真菌蛋白变化

3．6 抗真菌肽对真菌细胞膜通透性影响观察

3．7 电镜观察抗真菌肽对真菌形态的影响

3．8 SCGE观察抗真菌肽对真菌DNA的影响

4 讨论

4．1 家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽的制备及鉴定

4．2 抗真菌肽结构与功能的关系

4．4 抗真菌肽抗真菌机制

结论

参考文献

致谢

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