糖尿病肾小管上皮细胞中骨形态发生蛋白-7表达的信号通路调节及药物干预研究

摘要

骨形态发生蛋白-7（Bone morphogenetic protein-7，BMP-7）是近年来备受关注的与肾脏损害密切相关的细胞因子，糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)和其它肾脏疾病时肾小管上皮细胞BMP-7活性的丢失是肾小管间质纤维化的一个重要因素。已有研究发现使用外源性BMP-7可以改善肾脏纤维化病变，恢复肾功能，使已经发生的病变逆转。同时促进内源性BMP-7的表达及其调控机制的研究，也不失为一种值得探索的治疗方法。但是，目前对DN时内源性BMP-7表达的调节机制研究甚少。
　　我们和其他作者的研究表明，在糖尿病状态下，高血糖可通过蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PKCα)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)信号分子及通路将高糖信息传入细胞核，促进TGF-β和CTGF等促纤维化因子表达增多而使细胞表型和生长改变，促进胶原、纤维连接蛋白等细胞外基质合成增多、降解减少，使肾脏肥大和纤维化。由此我们推测，PKCα和p38MAPK既然介导了高糖促DN发病的病理信号而引起肾脏损伤，那么这些信号分子及通路可能也介导了糖尿病的病理信号而调节具有抗纤维化作用的BMP-7表达。然而高糖状态下PKCα或p38MAPK是否参与BMP-7的调节的研究未见报道。因此本课题在第一部分动态观察了体内和体外BMP-7表达的变化;第二部分分别探讨了BMP-7表达减少是否受PKCα和p38MAPK信号分子及通路的调节。
　　本课题组以往的研究表明含丹参和黄芪的中药复方制剂——丹芪合剂具有活血化瘀和益气养阴之功效，对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用，但其作用机制有待进一步研究。因此，本课题第三部分观察了丹芪合剂是否通过促进内源性BMP-7及其受体ALK-3的表达来发挥其对肾脏的保护作用及该作用是否与PKCα或/和p38MAPK的调节有关，希望从DM肾脏病变负调节的角度为DN的防治提供前瞻性实验依据和思路。
　　第一部分 糖尿病大鼠及高糖培养原代肾小管上皮细胞BMP-7表达变化的研究
　　目的:
　　动态观察DN大鼠不同时点的肾脏及高糖刺激不同时点的来自同种动物原代培养肾小管上皮细胞BMP-7的表达，以进一步探讨高糖与肾脏BMP-7表达变化之间的关系。
　　方法:
　　体内实验动物模型复制及分组:采用链脲佐菌素(STZ)55mg/kg一次性SD大鼠尾静脉注射造模，分为2w、4w、8w、12w、16w、24w糖尿病组(DM)及各相应时点正常对照组(N)。
　　体外实验同种动物原代肾小管上皮细胞培养鉴定及干预分组:正常糖（含糖5.5mM）组、高糖（含糖20mM）组和高渗（含甘露醇20mM）组，培养30min、2h、6h、12h、24h、48h、72h、96h和120h不同时点。
　　检测方法及指标:生化方法测定大鼠血糖、24h尿蛋白、血肌酐和肾脏指数，HE和PAS染色光镜观察肾脏病理改变，免疫组化检测肾组织BMP-7和FN蛋白的表达，Western blot和RT-PCR分别检测肾皮质和培养细胞BMP-7蛋白和mRNA及FN mRNA的表达，免疫荧光观察培养的肾小管上皮细胞BMP-7的蛋白表达。
　　结果:
　　生化指标及病理改变表明糖尿病(diabetes mellitus，DM)模型复制成功，原代培养之细胞鉴定为肾小管上皮细胞。体内体外实验显示糖尿病大鼠和原代培养的肾小管上皮细胞BMP-7的表达逐渐减少且mRNA水平降低早于蛋白减少，而FN的表达逐渐增多。
　　结论:
　　STZ诱导的SD大鼠糖尿病模型和高糖培养的原代肾小管上皮细胞中BMP-7蛋白和mRNA的表达减少。
　　第二部分 糖尿病和高糖状态细胞内信号通路对BMP-7表达的调控研究
　　目的:
　　观察PKCα信号分子或p38MAPK信号通路对糖尿病大鼠和原代培养的肾小管上皮细胞BMP-7表达的影响。
　　方法:
　　体内实验动物模型复制及分组:①方法同第一部分，分为16w和24wDM组及16wDMT和24wDMT组，其中DMT组动物从第13w起注射胰岛素控制血糖至正常范围;设同时点N组。②采用STZ50mg/kg一次性大鼠尾静脉注射造模，分为12wN组和DM组。
　　体外实验同种动物原代肾小管上皮细胞干预分组:(1)正常对照组，用DMEM+2％FCS培养;(2)高渗组，用20mM D-Mannitol+DMEM+2％FCS培养;(3)高糖组，用20mM D-Glucose+DMEM+2％FCS培养;(4) p38MAPK特异性抑制剂SB202190+HG处理组或PKCα特异性抑制剂G(O)6976+HG处理组，用SB20219020μmol/L或G(O)69761μmol/L+DMEM预处理细胞40分钟后弃预处理液，然后SB20219020μmol/L或G(O)69761μmol/L+20mM D-Glucose+ DMEM+2％FCS培养;72小时后收集细胞。
　　检测方法及指标:免疫组化检测肾组织BMP-7、p38MAPK、p-p38MAPK、PKCα、ANGⅡ、CTGF、α-SMA和FN蛋白的表达，免疫细胞化学检测培养的原代肾小管上皮细胞BMP-7、PKCα、ANGⅡ、α-SMA和FN蛋白的表达，Western blot检测培养的原代肾小管上皮细胞BMP-7、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表达水平，RT-PCR分别检测肾皮质和培养的原代肾小管上皮细胞BMP-7、PKCα和FN mRNA水平。免疫荧光观察培养的肾小管上皮细胞BMP-7的蛋白表达。
　　结果:
　　体内实验显示DM大鼠肾小管PKCα，p38MAPK和p-p38MAPK蛋白显著上调，并且与BMP-7蛋白呈显著负相关，在控制血糖后BMP-7蛋白和mRNA的表达水平显著上调，而p-p38MAPK、PKCα、α-SMA和FN蛋白表达显著下调。体外培养的原代肾小管上皮细胞使用特异性抑制剂抑制PKCα信号分子或p38MAPK信号通路后，高糖下调BMP-7被显著抑制。
　　结论:
　　体内外研究均表明PKCα信号分子或p38MAPK信号通路可能分别参与高糖下调BMP-7表达的机制。
　　第三部分 丹芪合剂和依那普利对DM大鼠肾小管上皮细胞BMP-7表达的影响
　　目的:
　　观察丹芪合剂和依那普利对DM大鼠肾小管上皮细胞BMP-7及其受体ALK-3、p38MAPK、PKCα、ANGⅡ和FN表达的影响，以期进一步探讨丹芪合剂防治DN的作用机制。
　　方法:
　　实验动物模型复制及分组:我们采用第二部分②批动物模型，在成模后丹芪合剂治疗组按2g/kg/d给药，依那普利治疗组按10mg/kg/d给药，药物碾磨掺入少量饲料中给予，连续12w。
　　检测方法及指标:生化方法测定大鼠血糖、24h尿蛋白、血肌酐和肾脏指数，PAS染色光镜观察肾脏病理改变，免疫组化检测肾组织BMP-7、PKCα、p38MAPK、ANGⅡ、CTGF和FN蛋白的表达，RT-PCR检测肾皮质BMP-7、ALK-3、PKCα和p38MAPK mRNA的水平。
　　结果:
　　丹芪合剂可上调DM大鼠肾小管上皮细胞BMP-7及其受体ALK-3的表达，而下调PKCα、p38MAPK、ANGⅡ、CTGF和FN的表达;相关性分析显示糖尿病、丹芪合剂组肾小管上皮细胞BMP-7分别与PKCα、p38MAPK、AngⅡ和FN蛋白的表达呈显著负相关。而依那普利也可上调DM大鼠肾小管上皮细胞BMP-7及其受体ALK-3的表达，尤ALK-3mRNA水平高于正常对照组，除p38MAPK mRNA水平外，肾小管上皮细胞PKCα、p38MAPK、ANGⅡ、CTGF和FN的表达均明显减少，相关性分析显示依那普利组肾小管上皮细胞BMP-7分别与PKCα、p38MAPK、AngⅡ、CTGF和FN蛋白的表达呈显著负相关。
　　结论:
　　丹芪合剂可能通过抑制PKCα和/或p38MAPK的活化，促进内源性BMP-7及其受体ALK-3表达增加，从而发挥对糖尿病大鼠肾小管间质损伤的保护作用。依那普利在促进内源性BMP-7及其受体ALK-3表达的上调和改善肾功能等方面的机制可能不同于丹芪合剂治疗组，但是治疗效果差异无统计学意义。

目录

英文缩略语

摘要

引言

第一部分 糖尿病大鼠及高糖培养原代肾小管上皮细胞BMP-7表达变化的研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二部分 糖尿病和高糖状态肾小管上皮细胞细胞内信号通路对BMP-7表达的调控研究

第一节 DM大鼠和高糖培养肾小管上皮细胞p38MAPK与BMP-7表达关系的研究

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二节 DM大鼠和高糖培养肾小管上皮细胞PKCα与BMP-7表达关系的研究

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第三部分 丹芪合剂和依那普利对DM大鼠肾小管上皮细胞BMP-7表达的影响

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

全文小结

论文创新点

参考文献

文献综述 肾脏纤维化的正、负调节因素

博士期间发表与学位论文相关论文情况

博士期间参加会议情况

参与课题情况

致谢

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