Pokemon蛋白在肝癌HepG2细胞中的促增殖、侵袭功能研究及GST--Pokemon融合蛋白的纯化

摘要

Pokemon基因（也称ZBTB7a基因）是目前已知的原癌基因，它所编码的Pokemon蛋白，既往被命名为FBI-1、LRF或OCZF，是POK((POZ/BTB andKruppel，POK)蛋白家族成员，在许多肿瘤中均高表达，例如淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和膀胱癌。Pokemon是第一个被发现的可变阅读框基因特异性转录抑制物，能和多种癌基因/抑癌基因产物相互作用，对于细胞分化和肿瘤产生起着重要作用。故Pokemon基因可作为基因治疗的一个有效靶点。 有研究显示，Pokemon蛋白在原发性肝癌组织中的阳性率明显高于癌旁及正常组织。本实验利用RT-PCR观察Pokemon在HCC及HepG2细胞中的表达量。构建Pokemon siRNA真核表达载体psiRNA并筛选其稳转细胞株。运用RT-PCR和Western blot技术验证干扰效果;分别应用CCK-8及Transwell小室分析psiRNA稳转株增殖和侵袭能力的变化，构建Pokemon原核表达载体并纯化GST融合蛋白并纯化Pokemon的GST融合蛋白。 实验结果RT-PCR显示HepG2细胞中Pokemon的mRNA高水平表达;RT-PCR分析及Western blot显示psiRNA稳转细胞株Pokemon的mRNA水平和蛋白表达明显下调;CCK-8分析显示psiRNA稳转细胞株生长活性明显下降;Transwell侵袭实验显示psiRNA稳转细胞株侵袭能力显著减弱;成功构建Pokemon原核表达载体并纯化出GST-Pokemon融合蛋白。 由此本实验成功构建的psiRNA对HepG2细胞中Pokemon的mRNA和蛋白表达具有显著抑制效果，Pokemon基因沉默能明显抑制HepG2细胞的生长活性和侵袭能力。原癌基因Pokemon在原发性肝癌中高表达，很可能与肝癌的发生、发展密切相关。

目录

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摘要

英文缩写词表

第一章 前言

1．1 Pokemon

1．1．1 Pokemon的发现

1．1．2 Pokemon的分布

1．1．3 Pokemon与肿瘤发生的关系

1．2 RNA干扰

1．3 GST作用多肽融合蛋白的纯化

1．4 小结

第二章 材料与方法

2．1 RNA干扰Pokemon对肝癌HepG2细胞生物功能学研究

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 GST多肽融合蛋白的纯化

2．2．1 材料

2．2．2 方法

2．3 统计学处理

第三章 结果与讨论

3．1 Pokemon在肝癌细胞HepG2中的表达

3．2 Pokemon siRNA真核表达载体的构建和干扰效果检测

3．3 Pokemon siRNA真核表达载体对HopG2细胞增值的影响

3．4 Pokemon siRNA真核表达载体对HepG2细胞迁移的影响

3．5 GST多肽融合蛋白的纯化

3．6 小结

第四章 讨论与展望

4．1 Pokemon与原发性肝癌(HCC)

4．2 RNAi技术检测Pokemon生物学功能

4．3 Pokemon结合蛋白的寻找

4．4 展望

参考文献

致谢