靶向共调节因子结合位点的RXRα新型抑制剂筛选与鉴定

摘要

类视黄醇Ⅹ受体(retinoidⅩ receptor，RⅩR)，是核受体超家族中重要的一员，在细胞的凋亡、分化、生长和脂类代谢的生理过程中均发挥了重要作用。而作为RⅩR关键亚型之一的RⅩRα，在许多疾病甚至癌症的发展过程中都存在表达水平或功能上的变异。因此，RⅩRα一直以来都是药物干预和治疗过程中重要且极具吸引力的靶点。
　　目前以RⅩRα为靶点的小分子化合物开发，主要针对其经典的配体结合区(LBP)。而本课题以虚拟筛选数据为基础，得到并鉴定了一个全新的RⅩRα抑制剂，其独特地结合于RⅩRα外表面共调节因子结合位点。
　　本课题初始阶段共选取了20万个商业化小分子作为筛选集，通过虚拟筛选手段，以小分子结合RⅩRα表面共调节子结合位点的潜力大小为指标，筛选得到化合物共15个。并进而采用报告基因手段评价这些化合物同RⅩRα的结合情况。结果显示:这些的化合物中，代号XZ8513的化合物具有最强的抑制活性。以此为基础，XZ8513的9个类似物被作为新的筛选集，进行第二轮筛选。筛选结果表明:在新的9个化合物中，XZ8533具有与XZ8513相似的抑制活性，同时针对RⅩRα的特异性也远高于XZ8513。
　　充分肯定了XZ8533的抑制活性后。体内和体外两种评价手段则被同时应用于验证该化合物是否结合于RⅩRα表面位点。在体外实验中，课题组采用了配体竞争性实验、TR-FRET和SPR等三种手段。结果表明:XZ8533无法同9-cis-RA竞争RⅩRα-LBP，但可以同辅助激活因子竞争共调节子结合位点，并在SPR实验中表现出同RⅩRα-LBD高度地亲和力(KD=4.88 x10-7 M)。说明其结合位点可能位于LBP以外，共调节子结合位点以内。在体内实验阶段，通过对RⅩRα及XZ8533的结构分析，大量RⅩRα突变体被构建并用于验证XZ8533的表面结合能力。本阶段实验结果表明:位于共调节因子结合区Val298位点的突变对XZ8533的活性产生了巨大影响，而LBP区的突变则基本不影响其活性。这一结果进一步阐明了XZ8533结合于RⅩRα表面的可能性。
　　围绕XZ8533的生理活性，本课题组也作了大量评价。结果表明:XZ8533能够有效抑制Akt的活化，同时亦可有效促进癌细胞凋亡。而其诱导凋亡的途径则与RⅩRα有关，是通过抑制TNFα诱导的p85α与tRⅩRα相互作用引发。
　　总而言之，本课题的实验结果表明XZ8533是一种结合于蛋白表面并能有效调节RⅩRα非基因型作用的小分子化合物，它的发现为后期研究更为安全、有效、可控的抗肿瘤药物提供了基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 核受体(nuclear receptors，NRs)概述

1．2 类视黄醇X受体(retinoid X receptor，RXR)

1．2．1 RXR简介

1．2．2 RXR的基因型功能

1．2．3 RXR的非基因型功能

1．3 虚拟筛选(Virtual Screening， in silico Screening)技术

1．4 针对核受体表面位点的药物筛选

1．5 PI3K／Akt信号通路

1．5．1 PI3K的结构与分类

1．5．2 Akt的结构和分类

1．5．3 PI3K／Akt信号通路途径及其调控

1．6 TNFα及其诱导的信号通

1．7 研究的目的、内容和意义

第二章 材料与方法

2．1 主要实验仪器

2．2 主要实验药品和试剂

2．3 菌株、细胞株和质粒

2．3．1 菌株

2．3．2 细胞株

2．3．3 质粒载体

2．4 引物

2．4．1 构建基于pCMV-Myc载体质粒所需的引物

2．4．2 构建基于pET15b载体质粒所需的引物

2．4．3 构建基于pBind载体质粒所需的引物

2．4．4 构建突变体质粒所需引物

2．5 DNA相关实验和方法

2．5．1 大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化

2．5．2 质粒DNA的提取

2．5．3 DNA的限制性内切酶消化

2．5．4 DNA的回收和纯化

2．5．5 DNA连接反应

2．5．6 PCR相关实验

2．6 细胞相关实验和方法

2．6．1 细胞培养

2．6．2 细胞转染

2．7 蛋白相关实验和方法

2．7．1 相关溶液

2．7．2 免疫印迹

2．7．3 免疫共沉淀

2．7．4 His-RXRα-LBD蛋白提取

2．7．5 TR-FRET实验方法

2．7．6 配体竞争性实验方法

2．7．7 SPR实验方法

2．8 报告基因法

2．9 MTT法

2．10 虚拟筛选法

2．11 统计处理方法

第三章 实验结果与分析

3．1 作用于RXRα特异性化合物的筛选与鉴定

3．1．1 RXRα特异性配体的首轮筛选

3．1．2 RXRα特异性配体的第二轮筛选

3．2 XZ8533结合于RXRα-LBP以外的部位

3．2．1 SPR法证实XZ8533与RXRα-LBD相结合

3．2．2 配体竞争及突变体实验证明XZ8533无法结合到RXRα-LBP

3．3 XZ8533结合于RXRα共调节子结合位点

3．3．1 TR-FRET显示XZ8533可干扰共激活肽的结合

3．3．2 突变实验显示XZ8533结合于RXRα-LBD表面Val298附近

3．4 XZ8533生物活性评价

3．4．1 XZ8533抑制癌细胞生长

3．4．2 XZ8533依赖RXRα诱导癌细胞凋亡

3．4．3 XZ8533阻碍tRXRα与p85α的相互作用

讨论与展望

1 通过虚拟筛选和报告基因法鉴定RXRα抑制剂

2 XZ8533结合于RXRα表面

3 XZ8533协同TNFα诱导依赖于RXRα的细胞凋亡

4 XZ8533能够干扰tRXRα与p85α的相互作用

结论

附录

参考文献

在学期间发表的论文

致谢