苦参碱通过非依赖RIP3途径诱导人胆管癌细胞程序性坏死机制的研究

摘要

最新的流行病学研究表明胆管癌的发生率日益增加[1]，并不易被早期诊断、放化疗效果差和手术后五年生存率少于5％[2]。因此，亟待明确胆管癌发生、发展和死亡的分子机制用以探索出其新的治疗方案。
　　苦参碱(Matrine)是从我国传统中药苦参的干燥根中提取出的一种生物碱活性单体成分，分子式为C15H24N2O，具有广泛的药理学作用。近年来越来越多的研究表明，苦参碱能在体内、体外对多种肿瘤细胞起作用，诱导肿瘤细胞死亡。然而，苦参碱诱导肿瘤细胞死亡的作用机制尚不明确。
　　程序性坏死（necroptosis）是指由死亡受体配基启动、通过死亡受体介导的以出现坏死样形态改变（包括电镜和PI染色阳性），可为Necrostatin-1(Nec-1)或敲除RIP1、RIP3所阻断，作为鉴别necroptosis的基本判定标准。此外，RIP3在细胞发生necroptosis中起着关键作用。
　　本论文以人胆管癌细胞系QBC939为研究对象，探讨苦参碱的抗肿瘤作用及其分子机制。我们通过研究发现，苦参碱在体外可诱导QBC939坏死，流式细胞仪检测PI染色呈现阳性，电镜下细胞膜完整性遭到严重破坏，细胞、细胞器肿胀，乃至崩解，而细胞核内染色质缺乏明显的形态改变。同时研究发现，苦参碱诱导QBC939坏死的现象能被Nec-1所抑制，并且通过PCR检测确定QBC939不表达RIP3和共聚焦激光显微镜观察MLKL发生膜转位。这些结果表明苦参碱在体外是依赖于非RIP3依赖通路来诱导人胆管癌细胞发生程序性坏死。
　　通过这些研究，较为详细地阐明了苦参碱在体外诱导人胆管癌细胞QBC939发生程序性坏死的作用与机制，为其作为分子靶点的抗胆管癌药物开发奠定理论基础，也为苦参碱在癌症治疗的临床应用提供科学的实验依据。

目录

声明

摘要

主要缩略语表

第一章 引言

1．1 细胞死亡

1．1．1 细胞凋亡

1．1．2 细胞坏死

1．1．3 细胞凋亡与细胞坏死的关系

1．2 Necroptosis

1．2．1 Necroptosis的特征

1．2．2 Necroptosis的机制

1．3 受体相互作用蛋白(RIP)

1．3．1 RIP1

1．3．2 RIP2

1．3．3 RIP3

1．3．4 RIP4

1．4 苦参碱的抗肿瘤研究

1．4．1 抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞分化

1．4．2 苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡

1．4．3 苦参碱抑制肿瘤细胞粘附与浸润转移

1．4．4 苦参碱可逆转肿瘤细胞的多药耐药性

1．4．5 苦参碱对肿瘤细胞原癌基因及抑癌基因表达的影响

1．4．6 苦参碱调节肿瘤细胞宿主免疫功能

1．5 本课题研究的目标、内容与意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞系

2．1．2 工具酶和抗体

2．1．3 主要化学试剂和耗材

2．1．4 细胞培养试剂

2．1．5 主要仪器

2．1．6 主要溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 细胞死亡率检测(Annexin V-FITC／PI双染法)

2．2．3 细胞全蛋白抽提

2．2．4 分离抽提细胞核、质和线粒体蛋白

2．2．5 抽提组蛋白

2．2．6 免疫共沉淀

2．2．7 BCA法测定蛋白浓度

2．2．8 Western Blot

2．2．9 质粒的中量提取

2．2．10 脂质体2000转染

2．2．11 PCR

2．2．12 免疫荧光

2．2．13 细胞内ROS水平检测

2．2．14 数据处理

第三章 实验结果

3．1 苦参碱诱导胆管癌细胞系QBC 939发生坏死

3．1．1 苦参碱对人胆管癌细胞系QBC 939死亡率的影响

3．1．2 苦参碱诱导人胆管癌细胞系QBC 939发生的死亡现象不被caspase抑制剂z-VAD所抑制

3．1．3 电镜下，苦参碱诱导人胆管癌细胞系QBC 939的死亡现象呈现坏死状态

3．2 苦参碱诱导人胆管癌细胞发生程序性坏死的分子机制

3．2．1 苦参碱诱导人胆管癌细胞系QBC 939发生的坏死现象能被Nec-1所抑制

3．2．2 苦参碱诱导人胆管癌细胞系QBC 939在不表达RIP3的情况下发生RIP1磷酸化

3．2．3 苦参碱对人胆管癌细胞系QBC 939中MLKL定位的影响

3．3 苦参碱影响胆管癌细胞QBC 939中AIF和H2AX的表达

3．3．1 苦参碱对人胆管癌细胞QBC 939中AIF定位的影响

3．3．2 苦参碱诱导人胆管癌细胞系QBC 939中H2AX发生磷酸化

3．3．3 苦参碱诱导胆管癌细胞系QBC 393中AIF和H2AX发生结合

3．4 苦参碱诱导人胆管癌细胞系QBC 939发生程序性坏死过程伴有ROS的产生

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢