天麻F1代RAPD及ISSR分子标记研究

摘要

目的：利用RAPD和ISSR标记对天麻进行种质鉴定，建立天麻RAPD和ISSR分子标记指纹图谱和聚类图，分析12个样品的遗传多样性，为天麻的遗传、育种及种质资源的保护和合理利用提供依据。
　　方法：1.本研究以贵州省境内毕节、大方、遵义不同种型的药用天麻的栽培品种F1代共12个样品为材料，采用改良CTAB法提取天麻F1代基因组DNA。
　　2.利用改良 CTAB提取方法提取 DNA,参考兰科部分植物多态性随机引物,筛选出2个重复性好、多态性强的引物扩增进行RAPD扩增。
　　3.运用单因素影响试验建立ISSR-PCR反应体系，
　　4．从10个ISSR引物中筛选出2个能得到有效扩增的引物，并通过对退火温度和循环次数的试验，建立适用于这2个ISSR引物的PCR程序。通过UPGMA聚类构建树状图，对12个样品遗传关系进行分析。
　　结果：1．通过改良CTAB法提取天麻基因组DNA所需时间相对较短，纯度较高，提取出来的DNA其OD260/280在1.70-1.90范围内；
　　2.筛选出2个重复性好、多态性强的引物扩增进行RAPD扩增，共得到138条带,其中92条表现出多态性,占总带数的66.67％，扩增位点分子量在200-2000bp之间。天麻的多态位点百分率在66.92%-85.9%。UPGMA聚类图表明.红天麻基本聚为一类，乌天麻聚为一类。
　　3．获得适用于本实验室的ISSR-PCR反应体系和扩增程序如下：PCR反应体系：每20μl的扩增反应混合液包括10× buffer2μl,25mLMgCl2（3.25mmol/L），dNTP（0.25mmol/L），引物(3μmol/L)，1U Taq酶（上海生工），以及25ngDNA模板；PCR反应程序：94℃预变性5min；40次循环，包括94℃变性1min，52-56℃退火1min，72℃延伸1.5min（Touch-down PCR），72℃延伸5min。其中退火温度因引物不同而异。
　　4．筛选出2个引物用于12个天麻样品的ISSR-PCR扩增，总共得到128个条带，其条带大小在200-2000bp范围内；天麻的多态位点百分率在66.7%-88.9%。UPGMA聚类图表明，红天麻基本聚为一类，乌天麻聚为一类，与RAPD标记基本吻合。
　　结论：1.采用改良CTAB法从天麻干品药材提取的基因组DNA纯度较好，浓度较高，适合PCR扩增。
　　2.本实验室天麻干品药材的ISSR-PCR反应体系和程序中，适宜的退火温度为52-56℃。
　　3.不同产地的红天麻与乌天麻各聚为一类，说明相同变型的天麻具有较近的遗传距离，与植物形态分型标准一致。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

1.前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验试剂

2.3 实验器材

2.4 实验方法

3.结果与分析

3.1 天麻基因组DNA的提取与检测

3.2 RAPD标记

3.3天麻ISSR-PCR 反应体系的优化

3.4天麻ISSR-PCR 反应程序的优化

3.5 ISSR指纹图谱的构建

3.7数据处理

4 讨论

4.1天麻基因组DNA的提取

4.3. ISSR反应体系的优化

4.4ISSR指纹图谱的构建及其遗传多样性

4.6 天麻种质资源改良和保护策略

参考文献

英文摘要

致谢

综述： 天麻研究概况及DNA分子标记在生药学中的应用