基于酶联免疫斑点技术的水痘—带状疱疹病毒中和抗体检测方法的建立

摘要

水痘-带状疱疹病毒(VaricellaZosterVirus，VZV)是引起水痘和带状疱疹的病原体，具有严重的危害性。目前已有基于vOka株的水痘减毒活疫苗上市，在较好地预防水痘的同时，却增加了接种者带状疱疹的发生风险。由VZV引发的带状疱疹目前尚缺乏特效治疗药物。VZV中和抗体在阻断病毒体内扩散及感染中起到重要的作用，同时也有望成为带状疱疹的特异治疗药物。然而，目前对于VZV中和抗体的检测方法仍存在许多问题，难于同时满足快速、准确、高通量的需求。为此，本研究探索建立一种新型的基于酶联免疫斑点法的VZV中和抗体高通量检测方法。
　　本研究首先探索获得可高效检测感染细胞内病毒抗原的检测抗体。由于膜蛋白是暴露在VZV颗粒表面的包膜组成成分，存在亲和表位和中和表位，因此本研究将探索获得具有良好反应特异性和检测灵敏度的VZV糖蛋白单抗。通过对VZV保护液成分优化和冻融时间的摸索制备获得高滴度的无细胞VZV病毒。将无细胞病毒免疫小鼠后筛选获得6株可特异性结合GlycoproteinK(gK)抗原的单克隆抗体。对这6株单克隆抗体进行进一步的表位鉴定，确定其关键亲和表位处于gK的281～295位氨基酸。选择其中一株单抗18A10进行进一步鉴定，确定了其最短结合表位和关键氨基酸位点的分布。本研究进一步制备了辣根过氧化物酶标记的18A10(HRP-18A10)用于VZV感染细胞的酶联免疫斑点检测，对系统进行检测时间、感染滴度等优化，成功建立了较为稳定的VZV中和抗体酶联免疫斑点检测方法。与传统的空斑减少法平行比较，新型酶联免疫斑点检测法对鼠血清标本的检测特异性为100％，检测结果一致性为95.65％，显示了新方法具有良好的可靠性。VZV中和抗体酶联免疫斑点检测法的检测时间仅需2天，可在96孔板中利用自动化的仪器设备进行快速检测，避免了传统方法的主观误差，有利于进行快速高通量检测。
　　综上所述，本研究通过筛选获得了VZV-gK的特异性单克隆抗体，并应用于建立VZV中和抗体酶联免疫斑点检测法，相比于空斑减少法，存在省时、高通量检测的明显优势，并且能够保证血清样本的检测正确率，可为临床血清的检测和实验室中和表位研究提供更多支持。

目录

声明

摘要

Abbreviations

第一章 前言

1 水痘带状疱疹病毒概述

2 VZV流行病学

3 VZV分子生物学特征

3．1 疱疹病毒科

3．2 水痘带状疱疹病毒形态学和基因组结构

4 糖蛋白研究进展

4．1 糖蛋白包膜在病毒传播过程中的重要性

4．2 糖蛋白的结构、功能及其相互作用

5 水痘-带状疱疹疫苗研究与应用

5．1 传统水痘疫苗

5．2 带状疱疹疫苗

5．3 亚单位疫苗

5．4 DNA疫苗

6 VZV体外检测手段

6．1 补体结合实验

6．2 免疫粘附血凝实验

6．3 酶联免疫吸附检测

6．4 膜抗原荧光抗体检测

6．5 空斑减少实验

7 水痘和带状疱疹的治疗进展

7．1 水痘和带状疱疹的治疗

7．2 PHN治疗

8 本论文研究的目的、思路和方法

第二章 材料与方法

1 材料

1．1 主要设备

1．2 常用耗材

1．3 菌株、质粒、细胞株、病毒株

1．4 分子生物学常用试剂

1．5 溶液及培养基配制

2 方法

2．1 常规分子生物学实验方法

2．2 常规细胞生物学实验方法

2．3 单克隆抗体的制备

第三章 结果与分析

1 重组VZV的培养

1．1 重组病毒的来源

1．2 VZV在ARPE-19中的传代

2 VZV无细胞病毒制备方法的研究

2．1 VZV病毒颗粒特殊性

2．2 保护液成分

2．3 冻融次数与保护液的影响

2．4 保护液pH对病毒活力的影响

2．5 冻融后的使用时效

2．6 长期的保存

3 VZV特异性单克隆抗体制备

3．1 无细胞病毒免疫Balb／c小鼠

3．2 多抗血清检测

4 抗体性质及鉴定

4．1 WB分析抗体性质

4．2 IF分析抗体性质

4．3 重组子转染鉴定抗体特异性

4．4 MAb 18A10表位鉴定

5 MAb 18A10在ELISPOT中的应用

5．1 ELISPOT概述

5．2 ELISPOT优化

5．3 病毒检测范围

6 中和酶联免疫斑点检测(N-ELISPOT)

6．1 N-ELISPOT的必要性

6．2 N-ELISPOT检测鼠血清

6．3 中和滴度的定义

6．4 N-ELISPOT和空斑减少法的比较

讨论

1 无细胞病毒

2 VZV单抗筛选

3 ELISPOT的局限与潜力

小结

参考文献

致谢

附录