消减免疫法筛选HPV型间杂合颗粒特异单克隆抗体及其表位研究

摘要

人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)的持续感染被证实是诱发女性宫颈癌的主要原因。世界范围内，每年由HPV感染所致癌症病例56万例，约占全球全部癌症新发病例的5％，死亡人数约20万;在中国，每年约有10万的妇女因HPV感染而导致宫颈癌，死亡病例约3万。宫颈癌是继乳腺癌之后严重威胁妇女健康的第二大疾病。与宫颈癌密切相关的高危型HPV有15种，要有效控制宫颈癌就必须有预防这15种型别HPV感染的疫苗。目前上市的2种疫苗只能预防HPV16和HPV18这两种高危型的感染，保护率约占70％。因此，开发多价预防疫苗具有重大意义，同时也面临巨大的挑战。
　　本文在实验室前期的研究基础上，通过HPV16L1的C175和HPV52L1的C428位点突变，获得两种突变蛋白，混合组装成均一的、与野生型VLP形态相似的杂合病毒样颗粒(VirusLikeParticle，VLP)。通过免疫原性考察，相同剂量的杂合VLP与野生型VLP所诱导的抗体水平相当，表明杂合VLP有作为广谱HPV疫苗的潜力。由于杂合VLP两个相邻五聚体之间只能形成一个二硫键，在空间结构上必然与野生型VLP不同，因此，杂合VLP有可能会产生新的功能表位，甚至可能产生新的广谱表位。因此，筛选出针对杂合VLP特异反应的单抗，同时通过该抗体分析杂合VLP相对于野生型VLP所产生的新表位具有重要意义。
　　本研究首先通过单克隆抗体筛选获得了针对于杂合VLP特异反应的单抗。在常规的免疫方法中，HPV杂合VLP的免疫血清抗体滴度与两种野生型免疫的抗体滴度相当，筛选获得的抗体差异性不大，且没有针对杂合VLP新表位的单抗。因此本研究采用环磷酰胺消减免疫法，环磷酰胺可以抑制非目的抗原的免疫原性，提高免疫系统对目的抗原的应答。本文针对HPV抗原的免疫进行一系列摸索，最后建立的消减免疫方案是:耐受阶段和免疫阶段均不使用佐剂，抗原剂量为20μg，腹腔注射，环磷酰胺剂量为100mg/kg。对消减次数的研究表明，耐受次数不影响免疫抑制的持久性，停止环磷酰胺处理后，免疫抑制状态可以维持4周。
　　本研究中，先使小鼠免疫系统对HPV16和HPV52野生型VLP的免疫无应答，再以杂合VLP免疫小鼠，使少量的五聚体杂合特异的表位免疫应答得到加强，提高特异抗体的阳性率，减少筛选工作量。筛选获得的抗体中，有2株抗体对杂合VLP特异，4株抗体对杂合VLP和野生型VLP的反应差异性在10倍以上。证实了环磷酰胺消减免疫法可以有效地制备差异性抗体。
　　我们接着利用分子模拟方法，对以上抗体识别的表位进行分析。选取杂合VLP的特异性抗体2B3，分别对抗体可变区和HPV16/52相邻五聚体进行同源模建和分子对接，预测出2B3与杂合VLP的相互作用区域在两个五聚体之间，关键氨基酸是HPV16五聚体的Ser170和Lys439，HPV52五聚体的Asn240、Ser255、Glu378、Lys382和Glu469。
　　综上所述，本研究通过对消减免疫方案的研究，建立了以HPV为抗原的消减免疫方案，由此筛选获得了杂合VLP特异性抗体和与野生型VLP具有较大差异性的抗体。利用生物信息学分子对接技术，进一步研究了特异性抗体识别的杂合VLP的特异表位。本研究获得的杂合VLP特异表位信息，对于了解HPVL1蛋白的分子进化，中和表位型别的特异性，杂合VLP组装的机制以及开发基于杂合VLP的HPV广谱疫苗具有重要的指导意义。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 前言

1．HPV简介

1．1 HPV基因组结构

1．2 HPV的组装

1．3 病毒的感染途径和传播方式

1．4 人乳头瘤病毒的分类

1．5 HPV的致病机制

1．6 HPV的流行病学

1．7 HPV的免疫

2．HPV疫苗的研究

2．1 预防性疫苗的研究

2．2 治疗性疫苗的研究

3．消减免疫的种类和应用

3．1 高区带耐受消减免疫法

3．2 新生期耐受消减免疫法

3．3 药物介导耐受消减免疫法

4．抗原表位的研究方法

4．1 氨基酸替换和突变技术

4．2 肽扫描技术

4．3 生物信息学工具预测分析

4．4 免疫复合物晶体结构解析

4．5 其他抗原表位研究方法

5．本研究的思路、目的和意义

第二章 材料与方法

1 仪器

2 主要耗材

3 主要试剂与实验动物

3．1 菌株、质粒、酶和软件

3．2 单克隆抗体、细胞株及实验动物

3．3 其它试剂

3．4 常见溶液及培养基的配制

4 方法

4．1 分子生物学实验方法

4．2 蛋白诱导表达、纯化及鉴定方法

5 小鼠免疫及免疫评价实验方法

5．1 小鼠常规免疫

5．2 小鼠消减免疫

5．3 融合杂交瘤的筛选

5．4 杂交瘤细胞的培养

5．5 单克隆抗体的制备及性质鉴定

5．6 单抗的表位鉴定

第三章 结果与分析

1．消减免疫方案的研究

1．1 小鼠免疫原的制备

1．2 HPV杂合VLP免疫原性考察

1．3 消减免疫耐受方案研究

1．4 消减次数对耐受持久性的影响

1．5 第一部分小结

2．HPV杂合颗粒单克隆抗体的筛选及性质鉴定

2．1 单抗细胞株的筛选及稳定单克隆细胞株的获得

2．2 单抗基本性质鉴定

2．3 第二部分小结

3．HPV杂合VLP表位的预测

3．1 单抗2B3可变区同源模建

3．2 HPV杂合VLP同源模建

3．3 Ramachandran plot评估

3．4 Profile-3D分析

3．5 单抗2B3-Fab与2个五聚体的分子对接

3．6 对接结果分子间氢键分析

3．7 对接结果的溶剂可及表面分析

3．8 单抗2B3识别表位的预测

3．9 第三部分小结

第四章 讨论

1 消减免疫方案的摸索

1．1 环磷酰胺作用原理

1．2 佐剂使用的分析

1．3 耐受原剂量的分析

1．4 环磷酰胺剂量的分析

1．5 消减次数的分析

1．6 消减免疫效果评价

2．HPV杂合VLP的结构

3．HPV杂合VLP表位的研究

4．HPV杂合VLP在疫苗中的应用

小结与展望

参考文献

致谢

附录