MEK抑制剂联合硫酸软骨素酶ABC对急性脊髓损伤后胶质瘢痕形成影响的实验研究

摘要

目的:观察联合应用MEK抑制剂(U0126)和硫酸软骨素酶ABC对大鼠急性脊髓损伤后胶质瘢痕中细胞成分及细胞外基质成分形成的影响，探索胶质瘢痕中不同组成成分与神经功能恢复之间的关系，初步研究联合应用MEK抑制剂和硫酸软骨素酶ABC对神经功能恢复的影响，进一步完善抑制脊髓损伤后胶质瘢痕形成的新思路并探寻脊髓损伤治疗的新策略。 方法:选择雌性SD大鼠96只。将实验动物随机分为脊髓损伤对照组(Ⅰ组，n=24)、脊髓损伤后ChABC干预组（Ⅱ组，n=24）、脊髓损伤后U0126干预组（Ⅲ组，n=24）及脊髓损伤后ChABC联合U0126干预组（Ⅳ组，n=24），各组又分为伤后1d，伤后7d，伤后14d及伤后28d等四个亚组，每个亚组各6只。 各组均用改良Allen's法[3]建立大鼠T10脊髓急性脊髓损伤模型，并在硬膜下放置PE-0402导管。Ⅰ组:SCI后30min内经导管注射生理盐水6μl，以后每日注射生理盐水6μl，连续1周;Ⅱ组:SCI后30min内，用微量注射器经导管向损伤局部注射6μL ChABC(1U/mL)，以后每日按该剂量注射，连续1周;Ⅲ组:SCI后30min内，用微量注射器经导管向损伤局部注射2μ L U0126(10mg/ml)，以后每日按该剂量注射，连续1周;Ⅳ组: SCI后30min内，用微量注射器经导管向损伤局部先注射6μL ChABC(1U/mL)然后再注射2μLU0126(10mg/ml)，再注射生理盐水6μl，以后每日按该剂量注射，连续1周。 在脊髓损伤前、伤后1d、7d、14d、28d对每组大鼠进行BBB评分。术后各组按预定时间点随机处死6只，取脊髓标本行HE染色、Nissl染色、GFAP/CSPGs双重免疫荧光染色，观察、计算阳性细胞数或阳性面积，软件分析蛋白积分吸光度。所得数据用SPSS17.0统计软件进行分析。 结果:(1) BBB评分:SCI后1天，所有大鼠BBB评分均接近为0分，脊髓损伤后随着时间的延长大鼠后肢运动功能表现出不同程度的恢复。SCI后1周各组动物两后肢仍拖行，足背着地，Ⅰ组BBB评分(4.33±0.88)分，Ⅱ组BBB评分(10.05±0.99)分，Ⅲ组BBB评分(7.69±1.24)分，Ⅳ组BBB评分(11.10±0.88)分，Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间BBB评分有明显统计学差异，P＜0.05;Ⅲ组与Ⅱ、Ⅳ组间BBB评分有明显统计学差异，P＜0.05;Ⅱ和Ⅳ组间BBB评分无明显统计学差异，P＞0.05。SCI后14天，所有大鼠后肢活动均较前有力，Ⅰ组BBB评分(4.37±0.91)分，Ⅱ组BBB评分(14.00±0.75)分，Ⅲ组BBB评分(11.76±1.35)分，Ⅳ组BBB评分(15.37±1.20)分，Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间BBB评分有明显统计学差异，P＜0.05;Ⅲ组与Ⅱ、Ⅳ组间BBB评分有明显统计学差异，P＜0.05;Ⅱ和Ⅳ组间BBB评分有明显统计学差异，P＜0.05。SCI后28天，所有大鼠均可以依靠后肢站立，Ⅰ组BBB评分(4.83±1.05)分，Ⅱ组BBB评分(16.27±1.28)分，Ⅲ组BBB评分(14.21±2.47)分，Ⅳ组BBB评分(18.21±0.87)分，Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间BBB评分有明显统计学差异，P＜0.05;Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间BBB评分有明显统计学差异，P＜0.05。 (2)组织学观察: ①HE染色:SCI后1d，损伤区出现大片坏死出血灶，神经元坏死、溶解，有大量嗜伊红色颗粒;SCI后7d，出血灶部分消失，炎症细胞大量浸润，坏死区域与周围分界尚不清楚，其中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组炎症细胞较少，可见胶质瘢痕形成;SCI后14d，损伤区脊髓出血灶基本吸收，仍可见炎症细胞浸润，但较前明显减少，可见囊腔及空洞形成，边界不清，胶质细胞大量增生并可见大量瘢痕形成;SCI后28天，有明显的空洞形成，边界清楚，可见大量胶质瘢痕。上述病变Ⅰ组较Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组重，Ⅱ、Ⅲ组相当，Ⅳ组较轻。 ②Nissl染色:伤后1d尼氏体分解成沙粒状、细尘状，甚至消失。从第2w到第4w，尼氏体逐渐恢复，从细颗粒状逐渐恢复成粗颗粒状，到第4周，可见Ⅳ组神经元数量最多、胞体最大，Ⅱ组次之，Ⅱ、Ⅳ组均优于Ⅲ组。 ③GFAP/CSPGs双重免疫荧光组织化学染色:术后脊髓损伤部位GFAP表达增加并开始出现CSPGs的表达，GFAP阳性表达主要集中于脊髓损伤区边缘，在损伤区内部少见，而CSPGs表达于脊髓损伤中心，集中于胶质界膜内部。SCI后2w，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组GFAP蛋白相对荧光强度值分别为(0.64±0.12)、(0.51±0.08)、(0.35±0.12)和(0.32±0.09)，Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组GFAP相对荧光强度值有明显统计学差异，P＜0.05;Ⅱ组与Ⅲ、Ⅳ组间有明显统计学差异，P＜0.05;Ⅲ组与Ⅳ组组间无明显统计学差异，P＞0.05;Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组CSPGs蛋白相对荧光强度值分别为(0.0732±0.0112)、(0.0493±0.0082)、(0.0613±0.0096)和(0.0327±0.0072)，Ⅰ组高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间CSPGs蛋白相对荧光强度值有明显统计学差异，P＜0.05;Ⅲ组高于Ⅱ、Ⅳ组间有明显统计学差异，P＜0.05;Ⅱ组高于Ⅳ组，有明显统计学差异，P＜0.05。SCI后4w，Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组GFAP蛋白相对荧光强度值分别为(0.66±0.12)、(0.40±0.11)、(0.27±0.10)和(0.13±0.05)，各组间比较均有明显统计学差异(P＜0.05);Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组CSPGs蛋白相对荧光强度值分别为(0.0683±0.0072)、(0.0460±0.0051)、(0.0555±0.0114)、(0.0207±0.0055),各组间CSPGs蛋白的相对荧光强度值组间比较均有统计学差异，P＜0.05。 ④6AP-43免疫组织化学染色:伤后1d，各组GAP-43的IA值无明显统计学差异，SCI后7天，Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间6AP-43的IA值有明显统计学差异，P＜0.05;Ⅲ组与Ⅱ、Ⅳ组间GAP-43的IA值有明显统计学差异，P＜0.05;Ⅱ和Ⅳ组间无明显统计学差异，P＞0.05。SCI后14天Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间GAP-43的IA值有明显统计学差异，P＜0.05; SCI后28天，各组间GAP-43的IA值均有统计学差异，P＜0.05。 结论: 1、U0126能抑制以GFAP为标记蛋白的星形胶质细胞的活化，ChABC能破坏瘢痕组织中的细胞外基质的主要成分CSPGs的葡胺聚糖链，影响瘢痕组织的形成，为轴突生长修复创造有利环境。 2、U0126与ChABC联合应用对大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕形成的抑制作用强于单因素的作用，两者可以协调作用抑制胶质瘢痕的形成。 3、胶质瘢痕化学屏障对轴突再生的抑制作用可能强于其物理屏障的抑制作用。

目录

声明

摘要

英汉缩略语名词对照

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 实验所用动物

2．2 实验所用主要试剂

2．3 主要实验仪器设备

2．4 主要实验方法

2．4．1 SCI模型的制备

2．4．2 术后护理

2．4．3 给药方法

第三章 观察指标和资料收集

3．1 一般观察

3．2 运动功能观察

3．3 脊髓标本收集及固定

3．4 组织形态学观察

3．5 统计学处理

第四章 结果

4．1 大鼠术后一般情况观察

4．2 动物行为学评分(BBB评分)

4．3 组织学观察

4．3．1 脊髓大体标本观察

4．3．2 HE染色

4．3．3 Nissl染色

4．3．4 GFAP／CSPGs双重免疫荧光组织化学染色

4．3．5 GAP-43免疫组织化学染色

第五章 讨论

5．1 SCI动物模型的选择及制备

5．2 胶质瘢痕概述

5．3 MEK抑制剂(U0126)概述

5．4 硫酸软骨素酶ABC(ChABC)概述

5．5 U0126与ChABC的联合应用

5．6 问题与展望

第六章 结论

参考文献

附录

附图

文献综述 硫酸软骨素酶ABC对脊髓损伤修复影响的研究进展

致谢

个人简历