拟穴青蟹耐寒相关基因ANT2、CCTα和SCD的分子克隆与胁迫应答

摘要

腺苷酸转移酶(adenine nucleotide translocase，ANT)，属于线粒体转运蛋白超家族，是线粒体中最丰富的蛋白质之一，主要作用是介导ADP/ATP在细胞质和线粒体基质之间的运输。伴侣素包含T型复合体(the chaperonin containingtailless complex polypeptideα，CCTα)是几乎存在所有生物体中的一类分子伴侣，负责细胞内蛋白的组装和折叠。内质网内的硬脂酰去饱和酶(stearoyl-CoAdesaturase，SCD)，是一类含铁离子的限速酶，主要催化硬脂酰辅酶A(C18∶0)和软脂酰辅酶A(C16∶0)向油酸(C18∶1)和棕榈油酸(C16∶1)等单不饱和脂肪酸的转化，并在C9-C10之间引入双键。为探讨这3个基因在拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)低温胁迫中的作用，本文采用RT-PCR、RACE等技术，首次从拟穴青蟹中获得了ANT2、CCTα、SCD的cDNA全长序列，并运用实时定量PCR技术检测了三个基因，在不同组织和不同温度以及不同温度盐度联合条件下的表达谱。主要结果如下:
　　1) ANT2的研究结果:
　　拟穴青蟹ANT2序列全长1348 bp，开放阅读框(ORF)为930 bp，编码309个氨基酸残基。同源分析显示，该蛋白具有3个保守的线粒体跨膜功能结构域;实时定量PCR结果表明，ANT2基因在成熟拟穴青蟹雌体的心脏组织中表达最高，其次分别是鳃和肌肉组织。在10℃、15℃、20℃和25℃等4个温度条件下，第一期仔蟹(C1)的ANT2基因在10℃和15℃表达量显著低于20℃和25℃，且10℃的表达量显著低于15℃;另外，随着温度降低，幼蟹ANT2基因总体上趋低表达。低温下C1仔蟹和幼蟹ANT2基因表达变化，提示该基因与能量代谢功能相关，可能参与拟穴青蟹低温胁迫应答;相同低温(10℃和15℃)下，幼蟹肌肉、肝胰腺、鳃三种组织中ANT2基因在盐度10的表达量通常高于盐度35，说明低温低盐条件下青蟹需要进一步提高体内代谢来应对环境胁迫。
　　2) CCTα的研究结果:
　　拟穴青蟹CCTα序列全长1972 bp，开放阅读框(ORF)为1668 bp，编码555个氨基酸残基。同源分析显示，该蛋白具有4个保守的功能结构域;实时定量 PCR结果表明CCTα基因在拟穴青蟹肌肉组织中表达量最高，其次是鳃和肝胰腺;幼蟹在4个温度下，肌肉、肝胰腺、鳃中CCTα基因表达量在10℃均显著高于15℃、20℃、25℃;15℃下的表达量显著高于20℃和25℃。这些数据表明该基因可能参与青蟹细胞中蛋白修复和细胞骨架构建的过程，来应对低温胁迫;在低温和盐度联合的实验中，相同低温(10℃和15℃)下，三种组织中CCTα基因在盐度35的表达量通常低于盐度10，说明低温下高盐环境对青蟹损伤较小。
　　3) SCD研究结果:
　　拟穴青蟹SCD序列全长1356 bp，开放阅读框(ORF)为1041 bp，编码347个氨基酸残基。同源分析显示，该蛋白具有4个跨膜区域和三个组氨酸功能区域;实时定量PCR结果表明SCD基因在拟穴青蟹所有检测组织中均有表达，且在肝胰腺组织中表达量最高;在4个温度下，C1期仔蟹SCD基因表达量在15℃均显著高于10℃、20℃、25℃;20℃和25℃二者之间差异不显著。SCD可能在增加不饱和脂肪酸进而增加细胞膜流动性中参与了拟穴青蟹低温胁迫应答。
　　综上所述，本研究发现拟穴青蟹存在ANT2、CCTα、SCD三个基因。这三个基因在低温下的表达模式和三个基因各自发挥的功能显示它们可能与青蟹的寒冷适应有关。研究结果可以为青蟹的健康养殖和耐寒机制研究提供理论指导。

目录

声明

缩略词中英文对照表

摘要

第一章 绪论

1．1 低温对甲壳动物的影响

1．2 甲壳动物对低温的适应

1．3 腺苷酸转移酶ANT2简介

1．4 伴侣素CCT简介

1．5 去饱和酶SCD简介

1．6 研究目的和意义

第二章 拟穴青蟹ANT2的cDNA序列的克隆与表达分析

2．1 拟穴青蟹ANT2的cDNA序列克隆

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 实验结果

2．2 拟穴青蟹ANT2基因的相对实时定量表达

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．2．3 实验结果

2．2．4 讨论

第三章 拟穴青蟹CCTα的cDNA序列的克隆与表达分析

3．1 拟穴青蟹CCTα的cDNA序列克隆与蛋白分析

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．1．3 实验结果

3．2 拟穴青蟹CCTα基因的相对实时定量表达

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．2．3 实验结果

3．2．4 讨论

第四章 拟穴青蟹SCD的cDNA序列的克隆与表达分析

4．1 拟穴青蟹SCD的cDNA序列克隆

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．1．3 实验结果

4．2 拟穴青蟹SCD基因的相对实时定量表达

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．2．3 实验结果

4．2．4 讨论

第五章 总结与展望

5．1 总结

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

在学期间参与的科研项‘目及成果

致谢